Summary
Ein neuartiger Ansatz, dass die hochauflösende Analyse von Krebs Zell-Interaktionen ermöglicht mit exogenen Hyaluronsäure (HA) beschrieben wird. Gemusterten Oberflächen werden durch die Kombination Carbodiimid Chemie und Mikrokontaktdrucken hergestellt.
Abstract
Cancer Invasion und Progression beinhaltet eine bewegliche Zelle Phänotyp, die unter komplexen Regulation durch Wachstumsfaktoren / Zytokine und extrazelluläre Matrix (ECM)-Komponenten in der Tumor-Mikroumgebung ist. Hyaluronsäure (HA) ist einer stromalen ECM-Komponente, die bekanntermaßen Tumorprogression durch Verbesserung der Invasion, Wachstum und Angiogenese 1 zu erleichtern wird. Interaktion von HA mit ihren Zelloberflächen-Rezeptor CD44 induziert Signal-Ereignisse, das Wachstum von Tumorzellen, das Überleben und die Migration zu fördern, wodurch Metastasierung 2-3. HA ist ein anionisches, nicht sulfatierten Glycosaminoglycan von sich wiederholenden Einheiten von D-Glucuronsäure und DN-Acetylglucosamin zusammen. Durch die Anwesenheit von Carboxyl-und Hydroxyl-Gruppen auf die Wiederholung Disaccharideinheiten, native HA weitgehend hydrophilen und zugänglich chemische Modifikationen, die Sulfatgruppen für photoreative Immobilisierung 4-5 einzuführen. Frühere Studien, die die Immobilisierung von HA auf Oberflächen nutzen die bioresistenten Verhalten der HA und seine sulfatierte Derivat Zelladhäsion auf Oberflächen 6-7 steuern. In diesen Studien Zelladhäsion bevorzugt auf Nichtspieler-HA strukturierten Gebieten.
Zur Analyse zellulärer Interaktionen mit exogenen HA, haben wir gemusterten funktionalisierten Oberflächen, die ein steuerbares Studie und hochauflösende Visualisierung der Krebszelle Interaktionen mit HA ermöglichen entwickelt. Wir verwendeten Mikrokontaktdrucken (UCP) zu diskreten strukturierten Gebieten HA auf Glasflächen zu definieren. A "Tethering"-Ansatz, dass Carbodiimid Verknüpfung Chemie gilt für HA immobilisieren wurde 8 verwendet. Glasflächen wurden Mikrokontakt mit einem Aminosilan gedruckt und reagierte mit einer HA-Lösung optimiert Verhältnis von EDC und NHS zum HA Immobilisierung in gemusterten Arrays ermöglichen. Die Einbeziehung Carbodiimid-Chemie mit MCP konnte die Immobilisierung von HA auf definierte Bereiche, die Schaffung Oberflächen geeignet für in-vitro-Anwendungen. Beide Dickdarmkrebszellen und Brustkrebszellen implizit mit der HA mikrostrukturierten Oberflächen interagiert. Krebs Zelladhäsion innerhalb von 24 Stunden mit der Proliferation von 48 Stunden eingetreten ist. Mit HA mikrostrukturierten Oberflächen haben wir gezeigt, dass Krebs Zelladhäsion erfolgt durch die HA-Rezeptor CD44. Darüber hinaus wurden HA gemusterten Oberflächen kompatibel mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und erlaubt hochauflösende Bildgebung der Krebszelle Klebstoff Vorsprünge und Verteilen auf HA-Muster zu Krebs Zellbewegung auf exogene HA analysieren.
Protocol
1. Standard-Photolithographie für mikrostrukturierten Stempel Fabrication
- Spülen Sie ein neues Silizium-Wafer mit Ethanol und trocken mit Luftstrom. Verwenden einer Pinzette, um Wafer Griff und verhindern Oberflächendefekte während des gesamten Prozesses.
- Transfer-Wafer-Coater Spin und decken Waferoberfläche mit SU-2025 negativer Photoresist. Abdeckung von mindestens 80% des Wafers mit Fotolack. Spin Mantel für 10 Sekunden bei 600U/min, um 30 Sekunden bei 3000rpm gefolgt. Aufgrund der Lichtempfindlichkeit der Fotolack, schalten Sie Raumbeleuchtung von diesem Punkt an.
- Transfer Fotolack beschichteten Silizium-Wafer zu heißen Platte für "Soft-bake" bei 95 ° C für 3 Minuten. Remove from Heizplatte und ermöglichen 1 Minute abkühlen lassen.
- Legen Sie eine vorgefertigte Maske mit dem gewünschten Muster auf der Oberseite des Fotolack bedeckt Silizium-Wafer und setzen mit ultraviolettem (UV) Bestrahlung (350-450 nm) für 20 Sekunden.
- Transfer-Silizium-Wafer zu heißen Platte für "hard-backen" bei 110 ° C für 6 Minuten.
- Schalten Sie die Beleuchtung ein und entfernen Wafer aus Heizplatte. Verschiedene Muster sichtbar sein soll an dieser Stelle.
- Sorgfältig abspülen Silizium-Wafer mit SU-8 Fotolack-Entwickler. Nach 3 Spülungen mit Entwickler-Lösung, mit Ethanol spülen. Wenn ein weißer Rückstand vorhanden ist, wiederholen Sie gründlich mit Fotolack Entwicklerlösung, oder einfach nur tauchen die Wafer in Entwickler-Lösung für 2 Minuten und fahren wieder mit Ethanol spülen. Sofort mit Wasser und der Luft trocknen.
- Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomer-Lösung und Härter im Verhältnis 10:1 Gewichtsverhältnis. Zentrifugation bei 900rpm für 5 Minuten, um Luftblasen zu entfernen.
- Ort strukturierten Wafer in Petrischale und gieße PDMS auf Silizium-Wafer. Wenn es Blasen, in Exsikkator und Vakuum für ein paar Minuten, bis Blasen verschwinden.
- Cure über Nacht bei Raumtemperatur (RT) mit einem komplementären elastomere Stempel zu bilden. Wenn PDMS ist nicht ganz nach 12 Stunden, im Ofen gehärtet bei 60 ° C für 30 Minuten.
- Entfernen Sie vorsichtig PDMS aus Silizium-Wafer. Verwenden des Messers Schneide, um Stempel auf die gewünschte Größe geschnitten. Mit Ultraschall in Ethanol für 15 Minuten. Waffeln kann mehrfach genutzt werden, um neue elastomere Stempel erstellen.
2. HA Mikrostrukturierung
- Plasma sauberen Glasobjektträger für 5 Minuten. Legen Sie alle Dias in die Kammer und Vakuum für 5 Minuten. Dann können geringe Zufuhr von Sauerstoff in die Kammer betreten. Schalten Sie Plasma-Reiniger auf 5 Minuten. Entfernen Sie aus dem Plasma-Reiniger und in einer Petrischale mit einer Pinzette.
- Während Plasma-Reinigung, beschallen PDMS-Stempel in Ethanol für 15 Minuten.
- Bereiten Sie eine neue 3% v / v Lösung von 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS) in 95% v / v Ethanol in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie für 5 Minuten bei RT reagieren, um eine Silanol bilden.
- Legen Sie PDMS-Stempel Muster-up auf Spin Coater Futter und Deckung strukturierte Oberfläche mit APTMS Lösung. Spincoat bei 3500rpm für 30 Sekunden. Berühren Sie nicht den Stempel Oberfläche, nur die Seiten des PDMS-Stempel.
- Transfer APTMS Lösung, um das Plasma zu reinigen Glasflächen: set Stempel nach unten auf ein Ende des strukturierten Seite und sanft gleiten Drücken PDMS so dass es vollständig in Kontakt mit Glasoberfläche für 1 Minute.
- Entfernen Sie vorsichtig PDMS-Stempel und damit Ornamentglas Folie in RT für 30 Minuten inkubieren. Spülen gemusterten Oberflächen mit Ethanol und an der Luft trocknen. Ultraschallbad PDMS für 15 Minuten, um überschüssige APTMS entfernen Stempel.
- Heizflächen im Ofen oder auf einer Heizplatte für 1 Stunde bei 115 ° C. Spülen mit Ethanol und trocken mit Luft.
- Bereiten Sie frische Polyethylenglykol (PEG)-Silan-Lösung von 20% v / v 2 - [Methoxy (Polyethylenoxy) propyl] trimethoxysilan in Toluol. Dies wird als nicht klebend Region um Muster dienen.
- Transfer-gemusterten Objektträger aus Glas, ein Glas-Petrischale und inkubieren in PEG-Silan-Lösung für 45 Minuten bei 75 ° C auf einer Heizplatte. Spülen mit Toluol, Wasser und trocken mit Luft.
- Sterilisieren für 1 Stunde mit UV-Bestrahlung keimtötende in einem biologischen Sicherheitsschrank. Gehen Sie in biologischen Sicherheitswerkbank von diesem Punkt an, um die Sterilität zu erhalten.
- Bereiten wässrige sterile HA-Lösung.
10mm 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC)
5mm von N-Hydroxy-
50 Mikrogramm / ml Fluorescein-markierten HA - Bewerben HA Lösung für die strukturierte Glassubstrate unter sterilen Bedingungen und vor Licht geschützt. Gemusterte Substrate sollten ungestört 16-24 Stunden.
- Absaugen HA-Lösung, mit Wasch-Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und Deckfläche mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 1 Stunde. Die Oberfläche ist nun bereit für die Zellkultur.
3. Cell Culture auf HA mikrostrukturierten Oberflächen
- Expand MDA-MB-231 Brustkrebszellen und LS174T kolorektalen Karzinom-Zellen, nach den Anweisungen des Herstellers.
- Seed einzelnen Zellsuspensionen von Krebszellen mit Dichten zwischen 0,4 und 1x10
- Zellkultur Oberflächen können bis zu 5 Tage in Standard-Inkubator Bedingungen eingehalten werden. Ändern Medien jeden zweiten Tag. Zellmorphologie und Wachstum zu beobachten mit invertierten Lichtmikroskop werden. Zusätzliche zellulären Assays angewendet, um Antworten auf die HA-Oberfläche analysieren.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Die Carbodiimid-Chemie verwendet werden, um kovalent zu immobilisieren HA APTMS Ornamentglas Dias ist in Abbildung 1A dargestellt. EDC ist ein Null-Länge Vernetzer, die mit HA Carboxylgruppen reagiert auf Amin-reaktiven Zwischenstufen zu bilden. Da dieser Zwischenstufe ist hydrolyseempfindlich ist NHS hinzugefügt Carbodiimidreaktion Effizienz zu steigern. Als HA-Lösung interagiert mit APTMS Mikrostrukturen, eine stabile Amidbindung bildet sich zwischen HA Zwischen-und primären Amin ATPMS. Ein Beispiel für HA gemusterte Oberfläche visualisiert mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops und einer ImageJ Fluoreszenzintensität Analyse zeigen die strukturierte Immobilisierung von HA dargestellt (Abbildung 1B-C).
Die HA mikrostrukturierten Oberflächen ermöglichen die Untersuchung von Krebszellen Interaktionen mit expgenous HA. Beide MDA-MB-231 menschlichen Brust und LS174T menschlichen Dickdarmkrebs-Zelllinien bevorzugt an HA mikrostrukturierten Regionen (Abb. 2) zu halten. Hochauflösende Bildgebung mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie können verwendet werden, um Wechselwirkungen von kultivierten Zellen mit HA immobilisierten Oberflächen (Abbildung 3) zu analysieren.
Abbildung 1 HA mikrostrukturierten Oberflächen (A) Schematische Beschreibung der Entwicklung der HA funktionale Oberflächen, (B) Fluoreszenzbild von Fluorescein (grün)-markiertem HA mikrostrukturierten Oberfläche. (C) 3D Pixelverteilung Karte mit ImageJ Software zeigt die diskrete HA-Muster. Maßstab = 100 um. Geändert von 9 mit Genehmigung von Elsevier.
Abbildung 2. Cancer Zelladhäsion auf mikrostrukturierten Oberflächen HA. Beide Doppelpunkt (A) und Brust (B) Karzinom bevorzugt auf HA-Patches mit 24 Stunden Kultur eingehalten werden. Geändert von 9 mit Genehmigung von Elsevier.
Abbildung 3. Cancer Zell-Interaktion mit HA. (A) Rasterelektronenmikroskopie Bilder von Darmkrebs-Zellen (A) kultiviert auf HA Oberflächen bei geringer Vergrößerung (links) und hoher Vergrößerung (rechts; der Quadrate auf der linken Seite) gezeigt und von Brustkrebszellen (B) auf HA Oberflächen gezeigt, bei kultivierten geringer Vergrößerung (links) und hoher Vergrößerung (rechts; der Quadrate auf der linken Seite).
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Discussion
Die HA Mikrostrukturierung vorgestellte Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-Interaktionen mit exogenen HA. HA ist bekannt, eine wichtige Rolle in der Tumorprogression 1 spielen jedoch gab es nur Studien zur Untersuchung der Wechselwirkung von Krebszellen auf zweidimensionalen HA gemusterten Oberflächen worden. Ein steuerbarer Studie über exogenen HA Mikrostrukturen ermöglicht hochauflösende Visualisierung von Krebs Zelladhäsion, das Wachstum und die Migration und kann weitere Grundlagen von Krebs aufzuklären.
Durch die Kombination von Carbodiimid Chemie und Mikrokontaktdrucken haben wir Flächen mit unterschiedlichen HA-Muster zu Krebs Zell-Interaktionen Studie entwickelt. Diese Methode ermöglicht es konsequent strukturierten Oberflächen mit Zellkultur-und Analysetechniken, einschließlich, aber nicht zu Immunfluoreszenzfärbung begrenzt, Rasterelektronenmikroskopie, Hemmung, Migration, etc.
Darüber hinaus ermöglichen photolithographischen Techniken die einfache Mikrofabrikation ein beliebiges Muster, die Immobilisierung von HA für spezifische Anwendungen zu steuern. Zum Beispiel würde Herstellung PDMS-Stempel mit linearer Streifen HA in einer linearen Anordnung immobilisieren und nützlich sein könnte bei der Analyse der Zellmigration entlang gemusterten HA.
Obwohl wir in erster Linie diese Methode, um Krebs Zell-Interaktionen mit HA Aufklärung genutzt haben, ist diese Technik für Interaktionen mit anderen Zelltypen zu untersuchen. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet, um eine breite Palette von HA-Moleküle zu immobilisieren. Die HA haben wir immobilisiert ist fluoreszierend mit einem Molekulargewicht von 800 kDa markiert. Allerdings HA reicht in der Größe von 2000 - hat 25000 wiederholenden Disaccharid-Einheiten, und zelluläre Antwort wurde gezeigt, dass abhängig von HA Molekulargewicht 10-11. Dieses Protokoll kann daher angewendet HA unterschiedlicher Molekulargewichte zu-Zell-Antwort auf exogene HA untersuchen zu immobilisieren.
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Disclosures
Video schematische Abbildung mit Genehmigung vervielfältigt, Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Rekonstruktion der Differenzierung Nische von embryonalen Stammzellen mit Biomaterialien. Macromol. Biosci. 2010; 21 Oktober. [Epub ahead of print].
Acknowledgments
Die Autoren danken den Einsatz der Oberflächenanalyse Laboratory an der Johns Hopkins, als Teil des Materials Science and Engineering Center durch die National Science Foundation finanziert. LED ist ein IGERT Praktikant und ein National Science Foundation Graduate Fellow. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH U54CA143868 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
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