Summary
一种新颖的方法，使高分辨率的癌症细胞间的相互作用分析与外源性透明质酸（HA）的描述。图案的表面结构相结合的碳二亚胺化学和微接触印刷。
Abstract
癌症入侵和发展涉及到一个能动的细胞表型，这是由生长因子/细胞因子和肿瘤微环境内的细胞外基质（ECM）组件的复杂的调控下。透明质酸（HA）是一个基质ECM的组成部分，是已知的便利通过加强入侵，生长和血管生成1的肿瘤进展。房委会的相互作用，其细胞表面受体CD44的诱导信号，促进肿瘤细胞生长，生存和迁移，，从而增加转移扩散2-3。房委会是一个阴离子，nonsulfated糖胺重复单位D -葡萄糖醛酸和DN -乙酰组成。由于存在重复的双糖单位的羧基和羟基，本土房委会介绍photoreative固定4-5硫酸基团的化学修饰，主要是亲水性和服从。以往的研究涉及到表面的HA immobilizations利用医管局bioresistant行为及其硫酸衍生工具来控制细胞粘附到表面6-7。在这些研究细胞粘附中优先发生在非医管局的图案地区。
为了分析外源性HA细胞相互作用，我们已经开发，使一个可控的研究和高分辨率的可视化与医管局的癌症细胞间的相互作用的官能表面图案。我们利用微接触印刷（UCP），玻璃表面上定义离散图案医管局地区。一个“圈养”的方法，适用于连接亚胺化学固定医管局的使用8 。玻璃表面微接触印刷与氨基硅烷和与EDC和NHS优化的比率，使图案阵列房委会固定的HA解决方案的反应。结合亚胺化学与MCP使房委会的固定定义的区域，创造合适的表面，在体外应用。结肠癌细胞和乳腺癌细胞的含蓄与医管局micropatterned表面相互作用。 48小时内发生的24小时与增殖的肿瘤细胞粘附。使用医管局micropatterned表面，我们表明，癌症细胞粘附通过HA受体CD44的发生。此外，医管局图案的表面，用扫描电子显微镜（SEM）和允许的癌细胞胶粘剂突起的高分辨率成像和医管局的模式传播到肿瘤细胞的运动分析外源性HA兼容。
Protocol
1。 Micropatterned标准光刻邮票制作
- 一个新的硅片用乙醇冲洗和干燥的空气流。使用镊子来处理晶圆，并防止在整个过程中的表面缺陷。
- 传输晶片，以旋转涂布机和SU - 2025负型光刻胶覆盖的晶圆表面。与光刻胶覆盖至少80％的晶圆。旋涂在600rpm 10秒，30秒3000RPM。由于光致抗蚀剂光敏性，关掉房间的灯，从这个点向前。
- 传输光致抗蚀剂涂硅晶片为“软烤”热板在95 ° C，3分钟。从热点板块中删除，并允许1分钟冷却。
- 光刻胶覆盖的硅片上放置所需的图案预先编造的面具，揭露紫外线（UV）辐射（350-450纳米），20秒。
- 硅片传输“硬烤”热板在110 ° C时6分钟。
- 开灯，从热点板块中删除的晶圆。不同的模式应该在这一点上可见。
- 仔细冲洗硅片与SU - 8光刻胶开发。 3显影液冲洗后，用乙醇冲洗。如果存在任何白色残留物，重复光阻显影液冲洗，或干脆淹没在显影液中的晶圆为2分钟，再继续用乙醇冲洗。洗涤与水和空气干燥。
- 混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体的解决方案和固化剂在10:1的重量比。在900RPM离心5分钟，以去除气泡。
- 图案在培养皿晶圆和倒到硅片上的PDMS。如果有气泡目前，在desicator地方和真空几分钟，直到气泡消失。
- 一夜之间在室温（RT）的固化，形成互补的弹性邮票。如果PDMS的是不能完全治愈后12小时，地点在60 ° C为30分钟，在烤箱。
- 小心地从硅片的PDMS。使用剃刀边缘削减印花税所需的大小。在乙醇中超声15分钟。晶片可以利用多次，创造新的弹性邮票。
2。医管局缩微
- 等离子体清洁玻片5分钟。放入5分钟的真空室和所有的幻灯片。接着让低流量的氧气进入室。打开5分钟，等离子清洁。从等离子体清洁和使用镊子在培养皿菜删除。
- 在等离子清洗，超声15分钟，在乙醇PDMS的邮票。
- 在95％V / V乙醇15 mL离心管中准备一个新鲜的3％，3 aminopropyltrimethoxysilane（APTMS）V / V解决方案。允许为5分钟，在室温下发生反应，形成一个硅醇基。
- 图案的PDMS的邮票图案上旋转涂布机夹头和覆盖面与APTMS解决方案。在3500RPM Spincoat为30秒。请勿触摸邮票表面，只有双方的PDMS邮票。
- 传输APTMS解决方案等离子清洗玻璃表面：集邮票面临的图案侧的一端，轻轻滑行，紧迫的PDMS，所以它完全是在与玻璃表面1分钟接触。
- 轻轻删除PDMS的邮票，并允许压花玻璃幻灯片在RT孵育30分钟。冲洗图案的表面，用乙醇和空气干燥。超声15分钟，以除去多余APTMS PDMS的邮票。
- 热烤箱或热板表面1小时，在115 ° C。用乙醇冲洗和干燥的空气。
- 准备新鲜的聚乙二醇（PEG）硅烷解决方案的20％V / V 2 - 甲氧基（polyethyleneoxy）丙基]在甲苯氧基硅烷。这将作为一个非粘性周边模式的地区。
- 转移压花玻璃幻灯片的玻璃培养皿中，在PEG硅烷溶液中孵育45分钟在75 ° C热板。甲苯，水和空气干燥冲洗。
- 为1小时的生物安全柜在使用紫外线杀菌照射消毒。继续在生物安全柜，从这个角度提出保持无菌。
- 准备无菌水的HA解决方案。
10mm的1 - 乙基-3 - （3 - dimethylaminopropyl）碳二亚胺（EDC）
5mm的N -羟基
50μg/ mL的荧光标记医管局 - 应用在无菌条件下的HA解决方案的压花玻璃基板和避光。图案基板应为16-24小时不受干扰。
- 吸HA解决方案，用磷酸盐缓冲液（PBS），表面覆盖1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS 1小时。现在准备细胞培养表面。
3。医管局Micropatterned表面的细胞培养
- 展开的MDA - MB - 231人类乳腺癌细胞和LS174T结肠癌细胞，根据制造商的指示。
- 癌细胞种子的密度在0.4和1 × 10之间的单细胞悬液
- 细胞培养表面可保持在标准的孵化器条件下5天。更改媒体隔日。使用倒光镜下可以观察到细胞的形态和生长。额外的细胞分析可用于分析HA表面。
4。代表性的成果：
碳二亚胺化学共价固定医管局APTMS压花玻璃幻灯片， 如图1a所示。 EDC是一个零长度的交联剂，与医管局羧基反应形成胺反应中间体。至于这中间是易水解，NHS的补充，增加碳二亚胺的反应效率。由于HA解决方案交互与APTMS微图案，医管局中间和伯胺ATPMS一个稳定的酰胺债券形式。医管局图案表面的一个例子观察用荧光显微镜和ImageJ的荧光强度分析，证明房委会的图案固定显示（图1B - C）。
医管局micropatterned表面使expgenous医管局癌症细胞间的相互作用研究。这两种MDA - MB - 231人乳腺癌和LS174T人结肠癌细胞株优先坚持医管局micropatterned地区（ 图2）。可用于高分辨率成像，利用扫描电子显微镜分析医管局固定的表面（ 图 3）培养细胞的相互作用。
图1 HA micropatterned表面（一）示意图描述的HA功能表面的发展，（二）荧光素的荧光图像（绿色）标记的HA micropatterned表面。 （三）使用3D像素分布图ImageJ软件演示离散医管局模式。比例尺=100μm的。从9修改与爱思唯尔的权限。
图2。癌症医管局micropatterned表面的细胞粘附。结肠癌（A）和（二）乳房癌优先坚持到房委会的修补程序与24小时的文化。从9修改与爱思唯尔的权限。
图3。癌症细胞之间的相互作用与医管局。 （一）扫描结肠癌细胞（一）在HA表面的培养在低倍率（左）和高放大倍率（右，在左边的平方）所示的电子显微镜图像和乳腺癌细胞（二）培养上载于房委会的表面低倍率（左）和高放大倍率（右左边的平方）。
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Discussion
医管局缩微方法允许与外源性房委会的细胞间相互作用的研究。房委会是众所周知的发挥了关键作用，在癌症的发展 1，但是也出现了有限的研究，调查医管局二维图案的表面相互作用的癌细胞。一个外源性HA微图案的可控性研究，使高分辨率的癌症细胞的粘附，生长和迁移的可视化，并可能进一步阐明癌的基本面。
亚胺化学和微接触印刷相结合，我们已经开发出具有鲜明的HA模式研究癌症细胞的相互作用的表面。此方法允许一贯图案的表面细胞培养和分析技术，包括兼容，但不限于免疫荧光染色，扫描电子显微镜，抑制，迁移等。
此外，光刻技术允许任何所需的模式很容易微细，为特定应用程序来控制固定医管局。例如，制造与线性条纹PDMS的邮票将固定在一个线性阵列HA和可沿图案房委会在分析细胞迁移非常有用。
虽然我们主要利用此方法，以澄清与医管局癌症细胞间的相互作用，这种技术适用于研究与其他类型的细胞的相互作用。此外，这个方法可以用来固定一个广泛的HA分子。我们有固定的房委会是一个分子量为800 kDa的荧光标记。然而，房委会从2000年的大小范围- 25000重复二糖单位，和细胞的反应，已被证明是依赖于房委会分子重量10-11。因此，这个协议可以被应用到固定医管局不同分子量调查外生房委会的细胞反应。
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Disclosures
视频原理的数字，经许可后转载版权WILEY - VCH出版社有限责任公司公司股份两合公司。迪金森LE，库苏马S，Gerecht南改造的胚胎干细胞的生物材料的分化利基。 Macromol。 Biosci。 2010年10月21日。 [EPUB的提前打印]。
Acknowledgments
作者承认在约翰霍普金斯大学，材料研究科学和工程研究中心通过国家科学基金会资助的表面分析实验室使用。 LED是IGERT学员和美国国家科学基金会研究生研究员。这项研究是由美国国立卫生研究院授予U54CA143868的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
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