Summary
Une nouvelle approche qui permet l'analyse de la haute résolution des interactions cellulaires du cancer avec l'acide hyaluronique exogène (HA) est décrite. Surfaces texturées sont fabriqués en combinant la chimie carbodiimide et l'impression par microcontact.
Abstract
L'invasion et la progression du cancer implique un phénotype cellulaire mobiles, qui est sous réglementation complexe de facteurs de croissance / cytokines et la matrice extracellulaire (ECM) des composants dans le microenvironnement de la tumeur. L'acide hyaluronique (HA) est une composante stromale ECM qui est connue pour faciliter la progression de la tumeur par l'invasion amélioration, la croissance et l'angiogénèse 1. Interaction des HA avec son récepteur cellulaire CD44 de surface induit événements de signalisation qui favorisent la croissance des cellules tumorales, la survie et la migration, augmentant ainsi la dissémination métastatique 2-3. HA est une anioniques, glycosaminoglycane nonsulfated composé d'unités répétitives de l'acide D-glucuronique et de DN-acétylglucosamine. En raison de la présence de groupes carboxyle et hydroxyle sur les unités disaccharide répéter, HA natif est largement hydrophiles et se prêtent à des modifications chimiques qui introduisent des groupes sulfate d'immobilisation photoreative 4-5. Des études précédentes impliquant le immobilisations de HA sur des surfaces d'utiliser le comportement bioresistant de HA et de son dérivé sulfaté de contrôler l'adhésion cellulaire sur des surfaces 6-7. Dans ces études de l'adhésion cellulaire survient préférentiellement sur les régions à motifs non-HA.
Pour analyser les interactions cellulaires avec HA exogène, nous avons développé motifs surfaces fonctionnalisées qui permettent une étude contrôlable et la visualisation haute résolution des interactions des cellules cancéreuses avec HA. Nous avons utilisé l'impression par microcontact (RUU) pour définir des motifs discrets régions HA sur les surfaces en verre. Un "tethering" approche qui s'applique la chimie carbodiimide reliant à immobiliser HA a été utilisé 8. Les surfaces vitrées ont été imprimés avec une microcontact aminosilane et réagir avec une solution HA des ratios d'EDC et optimisé afin de permettre l'immobilisation du NHS HA dans des tableaux à motifs. Incorporer la chimie carbodiimide avec MCP a permis l'immobilisation de l'HA à des régions définies, créant des surfaces appropriées pour les applications in vitro. Les deux cellules de cancer du côlon et de cellules du cancer du sein implicitement interagi avec les surfaces micropatterned HA. L'adhésion des cellules du cancer survenu dans les 24 heures avec la prolifération de 48 heures. L'utilisation de surfaces HA micropatterned, nous avons démontré que l'adhésion des cellules du cancer se fait par le CD44 récepteur HA. Par ailleurs, HA surfaces texturées étaient compatibles avec microscopie électronique à balayage (MEB) et a permis d'imagerie haute résolution des protubérances cellulaires du cancer adhésif et répandre sur les habitudes de HA pour analyser la motilité des cellules cancéreuses sur HA exogène.
Protocol
1. La photolithographie standard pour fabrication de timbres Micropatterned
- Rincer une nouvelle plaquette de silicium avec de l'éthanol et sécher avec un courant d'air. Utilisez une pince pour manipuler plaquette et éviter les défauts de surface pendant le processus entier.
- Transfert plaquette pour faire tourner coucheuse et couvrir surface de la galette avec les SU-2025 photoresist négatif. Couvrir au moins 80% de la plaquette de résine photosensible. Manteau de Spin pendant 10 secondes à 600rpm, suivie de 30 secondes à 3000rpm. En raison de la photosensibilité de la résine photosensible, éteindre les lumières Chambre à partir de ce point vers l'avant.
- Transfert photorésine plaquette de silicium recouvert la plaque chaude pour "soft-bake" à 95 ° C pendant 3 minutes. Retirer de la plaque chaude et laisser 1 minute pour refroidir.
- Placer un pré-fabriqués masque avec le motif désiré sur le dessus de la plaquette de silicium photosensible couvertes et d'exposer aux rayons ultraviolets (UV) (350-450 nm) pendant 20 secondes.
- Plaquette de silicium Transférer dans une assiette chaude pour "hard-bake" à 110 ° C pendant 6 minutes.
- Allumez les lumières et les retirer à partir de plaquettes plaque chauffante. Modèles distincts devraient être visibles à ce stade.
- Rincer soigneusement plaquette de silicium avec des SU-8 développeur résine photosensible. Après 3 rinçages avec une solution développeur, rincer avec de l'éthanol. Si aucun résidu blanc est présent, répétez rincer avec la solution de révélateur photosensible, ou tout simplement plonger la plaquette dans la solution de révélateur pendant 2 minutes et procéder à nouveau avec de l'éthanol rincer. Laver à l'eau et l'air sec.
- Mélanger polydiméthylsiloxane (PDMS) solution d'élastomère et de durcisseur dans un ratio de 10:1 poids. Centrifuger à 900rpm pendant 5 minutes pour enlever les bulles d'air.
- Placez motifs plaquette dans une boîte de Pétri et versez PDMS sur wafer de silicium. S'il ya des bulles présentes, dans dessiccateur sous vide pendant quelques minutes jusqu'à ce bulles disparaissent.
- Cure nuit à température ambiante (TA) pour former un tampon élastomère complémentaires. Si PDMS n'est pas complètement guéri après 12 heures, mettre au four à 60 ° C pendant 30 minutes.
- Retirer délicatement le PDMS à partir de plaquettes de silicium. Utilisez une lame de rasoir pour couper de timbre à la taille désirée. Soniquer dans l'éthanol pendant 15 minutes. Gaufrettes peut être utilisé plusieurs fois pour créer des timbres nouveaux élastomères.
2. Micropatterning HA
- Plasma nettoyage des lames de verre pendant 5 minutes. Placez toutes les diapositives dans la chambre et le vide pendant 5 minutes. Puis permettent à faible débit d'oxygène pour entrer dans la chambre. Tournez nettoyant plasma pendant 5 minutes. Retirer du plasma et plus propre place dans une boîte de Pétri en utilisant une pince.
- Pendant le nettoyage au plasma, soniquer timbres de PDMS dans l'éthanol pendant 15 minutes.
- Préparer une fraîche 3% v / v solution de 3-aminopropyltriméthoxysilane (APTMS) dans 95% v / v d'éthanol dans un tube à centrifuger de 15 ml. Laisser réagir pendant 5 minutes à température ambiante pour former un silanol.
- Placez timbre en PDMS structure en place sur les spin coater mandrin et la couverture à motifs de surface avec une solution APTMS. Spincoat à 3500rpm pendant 30 secondes. Ne touchez pas la surface du tampon, seulement les côtés d'un timbre en PDMS.
- Transfert APTMS solution pour le plasma nettoyé les surfaces de verre: jeu de timbres vers le bas sur une extrémité du côté de motifs et glissent doucement en appuyant sur PDMS ainsi il est complètement en contact avec une surface en verre pendant 1 minute.
- Retirez délicatement PDMS de timbre, et permettre à lame de verre à motifs à incuber en RT pendant 30 minutes. Rincer les surfaces modelées avec de l'éthanol et l'air sec. Soniquer PDMS timbre pour 15 minutes pour enlever l'excès APTMS.
- Surfaces de chaleur dans le four ou sur plaque chauffante pendant 1 heure à 115 ° C. Rincer avec de l'éthanol et sécher à l'air.
- Préparer le polyéthylène glycol frais (PEG)-silane solution de 20% v / v 2 - [méthoxy (polyéthylèneoxy) propyl] triméthoxysilane dans le toluène. Cela servira comme une région non-adhésif entourant les modèles.
- Transfert diapositives verre imprimé d'un plat en verre de Pétri et incuber dans le PEG-silane solution pendant 45 minutes à 75 ° C sur une plaque chauffante. Rincer avec du toluène, l'eau et sécher à l'air.
- Stériliser pendant 1 heure en utilisant irradiation UV germicide dans une enceinte de sécurité biologique. Procéder dans le cabinet de sécurité biologique à partir de ce point en avant pour maintenir la stérilité.
- Préparer une solution aqueuse de HA stérile.
10mm de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
5mM de N-hydroxysuccinimide
50μg / ml marquée à la fluorescéine HA - Appliquer la solution HA à des substrats de verre à motifs dans des conditions stériles et protégés de la lumière. Des substrats doit être au repos pendant 16-24 heures.
- Aspirer solution HA, laver avec du tampon phosphate salin (PBS), et couvrir la surface avec 1% d'albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS pendant 1 heure. La surface est maintenant prête pour la culture cellulaire.
3. Culture cellulaire sur HA Surfaces Micropatterned
- Développer MDA-MB-231 cellules humaines de cancer du sein et LS174T cellules carcinome colorectal, selon les instructions du fabricant.
- Suspensions semences cellule unique de cellules cancéreuses avec des densités comprises entre 0,4 et 1x10
- Surfaces de culture cellulaire peut être maintenue jusqu'à 5 jours dans des conditions incubateur standard. Changer les médias tous les jours. La morphologie cellulaire et la croissance peut être observé en utilisant un microscope à lumière inversée. D'autres dosages cellulaires peuvent être appliquées pour analyser les réponses à la surface HA.
4. Les résultats représentatifs:
La chimie carbodiimide utilisé pour immobiliser de façon covalente à des diapositives HA APTMS verre imprimé est montré dans la figure 1A. EDC est un agent de réticulation de longueur nulle qui réagit avec HA groupes carboxyle pour former une amine réactive intermédiaires. Comme cet intermédiaire est sensible à l'hydrolyse, le NHS est ajouté pour augmenter l'efficacité de réaction carbodiimide. Comme solution de HA interagit avec micropatterns APTMS, une des formes stables liaison amide entre HA intermédiaires et amine primaire de ATPMS. Un exemple de motifs de surface HA visualisés en utilisant un microscope à fluorescence et une analyse ImageJ intensité de fluorescence de démontrer l'immobilisation motifs de HA sont représentées (figure 1B-C).
Les surfaces HA micropatterned permettent l'étude des interactions des cellules cancéreuses avec HA expgenous. Les deux MDA-MB-231 maternel et LS174T humaine lignes cellulaires du cancer du côlon préférentiellement adhérer à HA régions micropatterned (figure 2). Imagerie à haute résolution en utilisant la microscopie électronique à balayage peuvent être utilisés pour analyser les interactions des cellules cultivées avec des surfaces HA immobilisé (figure 3).
Figure 1 HA surfaces micropatterned (A) Schéma décrivant le développement des surfaces fonctionnelles HA, (B) image de fluorescence de la fluorescéine (vert)-étiquetées HA micropatterned surface. (C) carte 3D répartition des pixels en utilisant le logiciel ImageJ démontrant les modèles HA discret. Barre d'échelle = 100 microns. Modifié à partir de 9 avec la permission d'Elsevier.
Figure 2. Adhérence des cellules du cancer sur les surfaces micropatterned HA. Les deux points (A) et du sein (B) le carcinome de préférence collé sur plaques HA avec 24 heures de culture. Modifié à partir de 9 avec la permission d'Elsevier.
Figure 3. Interactions cellulaires du cancer avec HA. (A) Numérisation d'images de microscopie électronique de cellules du cancer du côlon (A) cultivées sur des surfaces HA montré à faible grossissement (à gauche) et à fort grossissement (à droite; de carrés à gauche) et des cellules du cancer du sein (B) cultivées sur des surfaces HA montré à faible grossissement (à gauche) et à fort grossissement (à droite; de carrés sur la gauche).
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Discussion
La méthode présentée permet micropatterning HA l'étude des interactions cellulaires avec exogène HA. HA est connue pour jouer un rôle clé dans une progression du cancer mais il ya eu des études limitées étudie l'interaction des cellules de cancer sur deux dimensions surfaces texturées HA. Une étude contrôlables sur micropatterns HA exogène permet la visualisation haute résolution de l'adhérence des cellules cancéreuses, la croissance et la migration et peut élucider les fondamentaux supplémentaires de cancer.
En combinant la chimie carbodiimide et l'impression par microcontact, nous avons développé des surfaces avec des motifs distincts HA pour étudier les interactions des cellules cancéreuses. Cette méthode permet de surfaces uniformément motifs compatibles avec la culture cellulaire et des techniques d'analyse, y compris, mais non limité à la coloration par immunofluorescence, microscopie électronique à balayage, l'inhibition de la migration, etc
En outre, les techniques de photolithographie permettent la microfabrication facile de tout motif souhaité, afin de contrôler l'immobilisation de l'HA pour des applications spécifiques. Par exemple, la fabrication des timbres de PDMS avec des bandes linéaires serait immobiliser HA dans un réseau linéaire et pourrait être utile dans l'analyse de la migration des cellules le long motifs HA.
Bien que nous ayons d'abord utilisé cette méthode pour élucider les interactions des cellules cancéreuses avec HA, cette technique est applicable à l'étude des interactions avec d'autres types cellulaires. De plus, cette méthode peut être utilisée pour immobiliser un large éventail de molécules HA. Le HA, nous avons immobilisé est marqué par fluorescence avec un poids moléculaire de 800 kDa. Toutefois, les gammes ha de 2000 à 25000 unités disaccharide répéter, et la réponse cellulaire a été démontré pour être dépendant HA poids moléculaire 10-11. Ce protocole peut donc être appliquée pour immobiliser HA de différents poids moléculaires pour étudier la réponse cellulaire à HA exogène.
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Disclosures
Figure schématique vidéo reproduit avec la permission; auteur Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dickinson LE, S Kusuma, Gerecht S. Reconstruire la niche la différenciation des cellules souches embryonnaires utilisant des biomatériaux. Macromol. Biosci. 2010; le 21 octobre. [Epub ahead of print].
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent l'usage du laboratoire d'analyse de surface à l'Université Johns Hopkins, financé dans le cadre de la Science Materials Research and Engineering Center à travers la Fondation nationale des sciences. LED est un stagiaire et un IGERT National Science Foundation Graduate Fellow. Cette recherche a été partiellement financé par le NIH octroi U54CA143868.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
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