Summary
שיטה חדשנית המאפשרת ברזולוציה גבוהה ניתוח של אינטראקציות תאים סרטניים עם חומצה היאלורונית אקסוגניים (HA) מתואר. משטחים בדוגמת מיוצרים על ידי שילוב של כימיה carbodiimide והדפסה microcontact.
Abstract
הפלישה סרטן התקדמות כרוכה פנוטיפ התא ניעתי, אשר לפי תקנה מורכבים על ידי גורמי גדילה / ציטוקינים תאי המטריצה (ECM) רכיבים בתוך microenvironment את הגידול. חומצה היאלורונית (HA) הוא אחד סטרומה מרכיב ECM כי ידוע כדי להקל על התקדמות הגידול בעקבות הפלישה צמיחה ושיפור, ו אנגיוגנזה 1. אינטראקציה של HA עם שטח פני התא שלה CD44 לקולטן גורם איתות אירועים לקדם גדילת תאים והישרדות הגידול, והגירה, ובכך להגדיל את התפשטות גרורתית 2-3. HA הוא glycosaminoglycan anionic, nonsulfated מורכב יחידות חוזרות של חומצת D-glucuronic ו DN-acetylglucosamine. בשל נוכחותם של קבוצות הידרוקסיל על carboxyl ו disaccharide יחידות חוזרות, יליד HA הוא הידרופילי, במידה רבה, מקובל כי שינויים כימיים להציג קבוצות סולפט עבור immobilization photoreative 4-5. מחקרים קודמים הנוגעים immobilizations של HA על גבי משטחים לנצל את התנהגות bioresistant של HA ו - נגזרת sulfated שלה לשלוט הידבקות התא על גבי משטחים 6-7. בשנת הידבקות מחקרים אלה תא מעדיפים מתרחשת על אי - HA אזורים בדוגמת.
כדי לנתח אינטראקציות הסלולר עם HA אקסוגניים, פיתחנו משטחים פונקציונליות בדוגמת המאפשרים מחקר לשליטה ברזולוציה גבוהה ויזואליזציה של תאים סרטניים אינטראקציות עם HA. ניצלנו הדפסה microcontact (UCP) כדי להגדיר אזורים בדוגמת דיסקרטית של HA על משטחי זכוכית. "קשירה" הגישה כי חל כימיה carbodiimide קישור לשתק HA היה בשימוש 8. משטחי זכוכית היו microcontact מודפס עם aminosilane והגיב עם פתרון HA של יחסי אופטימיזציה של EDC ו NHS לאפשר immobilization HA במערכים בדוגמת. שילוב כימיה carbodiimide עם MCP אפשרה immobilization של HA לאזורים מוגדרים, יצירת משטחים מתאים ביישומים במבחנה. גם סרטן המעי הגס תאים תאים סרטן השד תיקשר במשתמע עם משטחים micropatterned HA. תא הידבקות בסרטן התרחש בתוך 24 שעות עם ריבוי על ידי 48 שעות. שימוש HA משטחים micropatterned, הראינו כי התא הידבקות בסרטן מתרחשת דרך הקולטן CD44 HA. יתר על כן, HA משטחים בדוגמת היו תואם מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) ואיפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים סרטניים בליטות דבק והפצת על דפוסי HA לנתח תאים סרטניים על תנועתיות HA אקסוגניים.
Protocol
1. Photolithography תקן ייצור הבולים micropatterned
- יש לשטוף את פרוסות סיליקון חדש עם אתנול יבש עם זרם של אוויר. השתמש מלקחיים לטפל רקיק למנוע מומים פני השטח במהלך התהליך כולו.
- העברת רקיק ספין coater ומכסים פני רקיק עם photoresist SU 2025 שלילי. כיסוי לפחות 80% של פרוסות סיליקון עם photoresist. ספין מעיל למשך 10 שניות בכל 600rpm, ואחריו 30 שניות על 3000rpm. בשל רגישות של photoresist, לכבות את האורות בחדר מרגע זה והלאה.
- העברת photoresist פרוסות סיליקון מצופה לצלחת חמה "רך לאפות" ב 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הסר מהצלחת חם ולאפשר 1 דקות להתקרר.
- המקום מסכה מראש מפוברק עם דפוס הרצוי על גבי פרוסות סיליקון photoresist המכוסה סיליקון לחשוף אולטרה סגול (UV), קרינה (350-450 ננומטר) למשך 20 שניות.
- העברת פרוסות סיליקון לצלחת חמה "קשה לאפות" ב 110 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות.
- כבה את האורות ולהסיר רקיק מהצלחת חם. דפוסים ברורים צריכים להיות גלויים בשלב זה.
- לשטוף בזהירות פרוסות סיליקון עם מפתח 8-SU photoresist. לאחר 3 שטיפות עם פתרון מפתח, לשטוף עם אתנול. אם שאריות לבן קיים, לחזור לשטוף עם פתרון מפתח photoresist, או פשוט להטביע את פרוסות בפתרון הפיתוח במשך 2 דקות ולהמשיך שוב עם אתנול לשטוף. לשטוף עם מים ואוויר יבש.
- מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) פתרון אלסטומר סוכן ריפוי ביחס 10:01 משקל. צנטריפוגה ב 900rpm במשך 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
- המקום בדוגמת רקיק בצלחת פטרי ויוצקים PDMS על פרוסות סיליקון. אם יש בועות בהווה, מקום desicator ואקום של כמה דקות עד בועות להיעלם.
- Cure הלילה בטמפרטורת החדר (RT) כדי ליצור חותמת אלסטומרי משלימים. אם PDMS לא נרפא לגמרי בתנור לאחר 12 שעות, במקום ב 60 ° C במשך 30 דקות.
- מוציאים בזהירות מן PDMS פרוסות סיליקון. השתמש קצה סכין גילוח לחתוך בול לגודל הרצוי. Sonicate באתנול במשך 15 דקות. ופלים יכול להיות מנוצל מספר פעמים כדי ליצור אלסטומרי בולים חדשים.
2. HA Micropatterning
- זכוכית פלזמה נקי שקופיות במשך 5 דקות. מקם את כל השקופיות לתוך תא ואקום במשך 5 דקות. ואז לאפשר זרימה נמוכה של חמצן להיכנס לתא. הפעל מנקה פלזמה על במשך 5 דקות. הסר מנקה פלזמה מקום בצלחת פטרי באמצעות מלקחיים.
- במהלך ניקוי פלזמה, sonicate בולים PDMS באתנול במשך 15 דקות.
- הכן טרי 3% v / v פתרון של 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) באתנול 95% v / v בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. אפשר להגיב במשך 5 דקות על RT כדי ליצור silanol.
- מקום דפוס חותמת PDMS-up על ספין coater צ'אק כיסוי בדוגמת משטח עם פתרון APTMS. Spincoat ב 3500rpm למשך 30 שניות. אל תיגע במשטח בול, רק את הצדדים של החותמת PDMS.
- העברת APTMS פתרון הפלזמה לנקות משטחי זכוכית: חותמת להגדיר פונה כלפי מטה בקצה אחד של הצד בדוגמת בעדינות להחליק לחיצה PDMS אז זה לגמרי במגע עם משטח זכוכית דקה 1.
- הסר PDMS חותמת בעדינות, ולאפשר שקופיות זכוכית בדוגמת כדי לדגור ב RT במשך 30 דקות. יש לשטוף את המשטחים עם הדפס של אתנול באוויר יבש. Sonicate PDMS חותמת במשך 15 דקות כדי להסיר APTMS עודף.
- מחממים משטחים בתנור או על פלטה חמה למשך שעה 1 ב 115 ° C. לשטוף עם אתנול יבש עם האוויר.
- הכן פוליאתילן גליקול טרי (PEG), silane פתרון של 20% v / v 2 - [methoxy (polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane ב טולואן. זה ישמש כאזור ללא דבק סביב דפוסים.
- העברת שקופיות בדוגמת זכוכית לצלחת זכוכית פטרי דגירה בפתרון PEG-silane במשך 45 דקות ב 75 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית. לשטוף עם טולואן, מים, אוויר יבש.
- לעקר שעה 1 באמצעות קרינה UV קוטל חידקים בארון בטיחות ביולוגית. המשך בארון בטיחות ביולוגית מנקודה זו קדימה כדי לשמור על סטריליות.
- הכן HA מימית פתרון סטרילי.
10mm של 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
5mm של N-hydroxysuccinimide
50μg / mL והעמסת שכותרתו HA - החל פתרון HA על מצעים בדוגמת זכוכית בתנאים סטריליים ומוגן מפני אור. Patterned מצעים צריך להיות באין מפריע במשך 16-24 שעות.
- לשאוב את פתרון HA, לשטוף עם פוספט בופר סליין (PBS), וכן לכסות את פני השטח עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב-PBS שעה 1. פני השטח מוכן כעת תרבית תאים.
3. Cell התרבות על HA micropatterned משטחים
- הרחב מד"א-MB-231 סרטן שד אנושיים לתאים תאים סרטן המעי הגס LS174T, על פי הוראות היצרן.
- תא זרע בודד השעיות של תאים סרטניים עם צפיפות בין 0.4 ו 1x10
- תרבות משטחים Cell יכול להישמר עד 5 ימים בתנאים סטנדרטיים חממה. שינוי התקשורת בכל יום אחר. מורפולוגיה של תאים והתפתחות ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה. מבחני הסלולר נוסף ניתן ליישם לנתח תגובות על פני השטח HA.
4. נציג תוצאות:
הכימיה carbodiimide משמש קוולנטית לשתק HA לשקופיות APTMS בדוגמת זכוכית מוצג באיור 1 א. EDC הוא סוכן באורך אפס crosslinking כי מגיב עם קבוצות carboxyl HA כדי ליצור אמין-reactive ביניים. כפי ביניים זה רגישים הידרוליזה, NHS נוסף כדי להגביר את יעילות התגובה carbodiimide. כפתרון HA אינטראקציה עם APTMS micropatterns, קשר יציב בין HA אמיד צורות ביניים אמין העיקרי של ATPMS. דוגמה השטח בדוגמת HA דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתוח הקרינה ImageJ להדגים את עוצמת immobilization בדוגמת של HA מוצגים (איור 1 ב-C).
Micropatterned משטחים HA לאפשר את לימוד אינטראקציות תאים סרטניים עם HA expgenous. שניהם מד"א-MB-231 שד אנושי LS174t האדם סרטן המעי הגס שורות תאים מעדיפים לדבוק האזורים HA micropatterned (איור 2). הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ניתן להשתמש כדי לנתח את האינטראקציות של תאים בתרבית עם משטחים HA משותקת (איור 3).
איור 1 HA micropatterned משטחים (א) סכמטי המתאר את התפתחות משטחים HA פונקציונלי, (ב) תמונה של הקרינה והעמסת (ירוק), שכותרתו משטח HA micropatterned. (ג) הפצה 3D המפה פיקסל באמצעות תוכנת ImageJ הוכחת דפוסי HA בדידים. בר סולם = 100μm. השתנה מ - 9 באישור Elsevier.
2. איור סרטן תא הדבקה על משטחים HA micropatterned. שניהם המעי הגס (א) ו השד (ב) דבק קרצינומה מועדף על תיקוני HA עם 24 שעות של תרבות. השתנה מ - 9 באישור Elsevier.
3. איור סרטן תאים אינטראקציה עם HA. (א) סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של תאים סרטניים במעי הגס (א) בתרבית על משטחים HA שמוצג בהגדלה נמוכה (משמאל) הגדלה גבוהה (מימין; של ריבועים על שמאל) של תאים סרטניים בשד (ב) בתרבית על משטחים HA הראו ב בהגדלה נמוכה (משמאל) הגדלה גבוהה (מימין; הריבועים בצד שמאל).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה מאפשרת micropatterning HA הציג את המחקר של אינטראקציות עם התא HA אקסוגניים. HA ידוע לשחק תפקיד מפתח בהתפתחות סרטן 1 אך היו מחקרים מוגבל לחקור את האינטראקציה של תאים סרטניים על שני משטחים HA ממדי בדוגמת. מחקר לשליטה על micropatterns אקסוגניים HA מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של הידבקות בסרטן התא, צמיחה, הגירה עשויה להבהיר יסודות נוספים של סרטן.
על ידי שילוב של כימיה carbodiimide והדפסה microcontact, פיתחנו משטחים עם דפוסים ברורים HA ללמוד תא אינטראקציות סרטן. שיטה זו מאפשרת משטחים בדוגמת בעקביות תואם תרבית תאים וטכניקות ניתוח כולל, אך לא רק מכתים immunofluorescent, עיכוב מיקרוסקופיית אלקטרונים,, הגירה, וכו '
בנוסף, טכניקות photolithographic לאפשר microfabrication קל של דפוס שתחפוץ, לשלוט immobilization של HA עבור יישומים ספציפיים. לדוגמה, בודה בולים PDMS עם פסים ליניארי היה לשתק HA מערך ליניארי יכול להיות שימושי ניתוח נדידת תאים לאורך בדוגמת HA.
אמנם יש לנו מנוצל בעיקר בשיטה זו כדי להבהיר תא אינטראקציות עם סרטן HA, טכניקה זו החלה על מחקר אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לשתק מגוון רחב של מולקולות HA. HA יש לנו משותקת הוא שכותרתו fluorescently עם משקל מולקולרי של 800 kDa. עם זאת, טווחי HA בגודל 2000-25000 יחידות disaccharide חוזרות, תגובה תאית הוכח להיות תלויים משקל מולקולרי HA 10-11. פרוטוקול זה ולכן יכול להיות מיושם כדי לשתק HA של משקולות משתנות מולקולרית לחקור תגובת התא HA אקסוגניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
דמות סכמטית וידאו לשכפל באישור; זכויות יוצרים Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA. דיקינסון LE, Kusuma S, Gerecht ס שחזור נישה התמיינות של תאים עובריים באמצעות biomaterials. Macromol. Biosci. 2010: אוקטובר 21. [Epub לפני ההדפסה].
Acknowledgments
המחברים מודים השימוש במעבדה ניתוח השטח באוניברסיטת ג'ונס הופקינס, במימון כחלק חומרים מדע והנדסה מרכז מחקר באמצעות הקרן הלאומית למדע. LED הוא המתאמן IGERT ו עמית קרן המדע הלאומית בוגר. מחקר זה מומן חלקית על ידי מענק NIH U54CA143868.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
- Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
- Hamilton, S. R. The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells. Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).
- Götte, M., Yip, G. W. Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective. Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).
- Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response. Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).
- Barbucci, R. Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule. Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).
- Morra, M., Cassinelli, C. Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).
- Khademhosseini, A. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).
- Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells. Biomaterials. 28, 825-835 (2007).
- Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid. Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).
- Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).
- Slevin, M. Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways. Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).
