Summary
Un nuevo enfoque que permite el análisis de la alta resolución de las interacciones de célula de cáncer con exógena de ácido hialurónico (HA) se describe. Superficies modeladas se fabrican mediante la combinación de la química y la impresión por microcontacto carbodiimida.
Abstract
Invasión y progresión del cáncer consiste en un fenotipo de células móviles, que se encuentra bajo una regulación compleja de factores de crecimiento / citocinas y componentes de la matriz extracelular (ECM) en el microambiente del tumor. El ácido hialurónico (HA) es un componente del estroma ECM que se conoce para facilitar la progresión del tumor por la invasión de la mejora, el crecimiento y la angiogénesis 1. Interacción de HA con su superficie celular CD44 receptor induce eventos de señalización que promueven el crecimiento celular del tumor, la supervivencia y la migración, aumentando así la diseminación metastásica 2-3. HA es un glicosaminoglicano aniónicos, nonsulfated compuesto por unidades repetidas de ácido D-glucurónico y DN-acetilglucosamina. Debido a la presencia de grupos carboxilo e hidroxilo en las unidades de disacárido repetir, HA nativo es en gran parte hidrofílica y es susceptible de modificaciones químicas que introducen grupos sulfato para la inmovilización de photoreative 4-5. Los estudios anteriores referentes a la inmovilización de HA en las superficies de utilizar el comportamiento bioresistant de HA y sus derivados sulfatados para controlar la adhesión celular en las superficies de 6-7. En estos estudios de forma preferente la adhesión celular se produce en las regiones no-HA patrón.
Para el análisis de las interacciones celulares con HA exógeno, se han desarrollado patrones superficies funcionales que permiten un estudio controlable y de alta resolución de visualización de las interacciones de célula de cáncer con HA. Hemos utilizado la impresión microcontacto (UCP) para definir regiones discretas patrón de HA en la superficie de vidrio. A "tethering" enfoque que se aplica la química que une carbodiimida para inmovilizar HA fue utilizada 8. Las superficies de cristal se microcontacto impresa con una aminosilano y reaccionó con una solución de HA de las relaciones optimizada de la EDC y NHS para permitir la inmovilización en matrices de estampado HA. La incorporación de la química carbodiimida con MCP permitió la inmovilización de HA de regiones definidas, la creación de superficies aptas para aplicaciones in vitro. Tanto las células de cáncer de colon y las células de cáncer de mama implícitamente interactuado con la superficie de HA micropatterned. Adhesión de las células cancerosas se produjo dentro de las 24 horas, con la proliferación de las 48 horas. HA utilizando superficies micropatterned, hemos demostrado que la adherencia de las células cancerosas se produce a través del receptor CD44 HA. Por otra parte, HA superficies modeladas eran compatibles con microscopía electrónica de barrido (SEM) y de imágenes permitió a alta resolución de las protuberancias del cáncer de células adhesivo y la difusión en los patrones de HA para analizar la motilidad de las células cancerosas en HA exógeno.
Protocol
1. La fotolitografía estándar para la fabricación de sellos micropatterned
- Aclarar una oblea de silicio nuevo con etanol y secar con corriente de aire. Use unas pinzas para manipular la oblea y prevenir los defectos de la superficie durante todo el proceso.
- Transferencia de obleas para hacer girar recubrimiento y cubrir la superficie de la oblea con el SU-2025 fotosensible negativa. Cubrir al menos el 80% de la oblea con fotoprotector. Giro capa durante 10 segundos a 600 rpm, seguido de 30 segundos a 3000 rpm. Debido a la fotosensibilidad de la fotosensible, apagar luces de la sala a partir de ahora.
- Transferencia de obleas de silicio fotosensible recubierto con placa caliente de "soft-cocer al horno" a 95 ° C durante 3 minutos. Retire de la placa caliente y dejar un minuto para enfriar.
- Coloque una pre-fabricados máscara con el modelo deseado en la parte superior de la oblea de silicio fotosensible cubierto y exponer a los rayos ultravioleta (UV) (350-450 nm) durante 20 segundos.
- Transferencia de obleas de silicio de la placa caliente de "hard-cocer al horno" a 110 ° C durante 6 minutos.
- Encienda las luces y retirar la oblea de la placa caliente. Distintos patrones deben ser visibles en este momento.
- Enjuagar cuidadosamente oblea de silicio con SU-8 desarrollador fotosensible. Después de tres enjuagues con solución reveladora, enjuagar con etanol. Si cualquier residuo blanco, repita enjuague con solución reveladora fotosensible, o simplemente sumergirse en la oblea solución reveladora durante 2 minutos y proceder de nuevo con etanol enjuague. Lavar con agua y aire seco.
- Mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS) solución de elastómero y agente de curado en una proporción de 10:1. Centrifugar a 900 rpm durante 5 minutos para eliminar las burbujas de aire.
- Lugar con dibujos de obleas en una placa de Petri y verter PDMS en oblea de silicio. Si hay burbujas presentes, lugar en desecador de vacío y un par de minutos hasta que las burbujas desaparezcan.
- Curar toda la noche a temperatura ambiente (TA) para formar un sello elastomérico complementarias. Si PDMS no sana completamente después de 12 horas, lugar en el horno a 60 ° C durante 30 minutos.
- Retire con cuidado PDMS de oblea de silicio. Use un filo de la navaja para cortar el sello al tamaño deseado. Sonicado en etanol durante 15 minutos. Obleas se pueden utilizar varias veces para crear nuevos sellos de elastómero.
2. HA micropatterning
- Plasma de vidrio limpio se desliza por 5 minutos. Coloque todos los portaobjetos en la cámara de vacío y durante 5 minutos. A continuación, permitir el flujo bajo de oxígeno para entrar en la cámara. A su vez limpio el plasma durante 5 minutos. Eliminar de limpiador de plasma y colocarlo en una placa de Petri con las pinzas.
- Durante la limpieza de plasma, ultrasonidos sellos PDMS en etanol durante 15 minutos.
- Preparar un nuevo máximo de 3% v / v de 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) en el 95% v / v de etanol en un tubo de centrífuga de 15 ml. Dejar actuar durante 5 minutos a temperatura ambiente para formar un silanol.
- Coloque el sello del patrón de PDMS-up sobre la transferencia de aplicador plato y cubrir con una solución de modelado de superficie APTMS. Spincoat a 3500 rpm durante 30 segundos. No toque la superficie del sello, sólo los lados del sello PDMS.
- Transferir la solución a la APTMS plasma limpiar las superficies de vidrio: El sello de conjunto hacia abajo en un extremo del lado del patrón y se deslizan suavemente presionando PDMS lo que es completamente en contacto con la superficie del vidrio durante 1 minuto.
- Retire con cuidado el sello PDMS, y permitir que la diapositiva patrón de vidrio para la incubación en RT durante 30 minutos. Enjuague las superficies modeladas con etanol y secar al aire. Sonicar PDMS sello durante 15 minutos para eliminar el exceso de APTMS.
- Las superficies de calor en el horno o en la placa caliente durante 1 hora a 115 º C. Enjuagar con etanol y secar con aire.
- Prepare polietilenglicol fresca (PEG)-silano solución de 20% v / v 2 - [metoxi (polietilenoxi) propil] trimetoxisilano en tolueno. Esto servirá como una región no adhesiva alrededor de los patrones.
- Transferencia de lámina de vidrio con dibujos a un plato de Petri de vidrio y se incuban en PEG-silano solución durante 45 minutos a 75 ° C en un plato caliente. Enjuague con tolueno, el agua y secar con aire.
- Esterilizar durante 1 hora con irradiación germicida ultravioleta en una cámara de seguridad biológica. Proceder en el gabinete de seguridad biológica a partir de ahora para mantener la esterilidad.
- Prepare una solución acuosa estéril HA.
10 mM de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)
5 mM de N-hidroxisuccinimida
50 microgramos / ml marcado con fluoresceína HA - Aplique una solución de HA a los sustratos de vidrio con dibujos en condiciones de esterilidad y protegido de la luz. Estampados sustratos deben ser molestados durante 16-24 horas.
- Aspirar de solución de HA, lavar con tampón fosfato salino (PBS), y cubrir la superficie con bovino al 1% de albúmina sérica (BSA) en PBS durante 1 hora. La superficie ya está lista para el cultivo celular.
3. Cultivo de células en superficies HA micropatterned
- Ampliar MDA-MB-231 células humanas de cáncer de mama y LS174T células carcinoma colorrectal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Suspensiones de semillas de células individuales de las células cancerosas con una densidad de entre 0,4 y 1x10
- Las superficies de cultivo celular puede mantenerse hasta por 5 días en condiciones estándar de la incubadora. Cambiar los medios de comunicación todos los días. Morfología de las células y el crecimiento se puede observar con microscopio de luz invertida. Otros ensayos celulares se pueden aplicar para analizar las respuestas a la superficie de HA.
4. Los resultados representativos:
La química carbodiimida para inmovilizar covalentemente HA a las diapositivas de cristal APTMS patrón se muestra en la Figura 1. EDC es un agente de reticulación de longitud cero que reacciona con grupos carboxilo HA para formar amina reactiva intermedios. Ya que este medio es susceptible a la hidrólisis, NHS se agrega para aumentar la eficacia de la reacción de carbodiimida. Como solución de HA interactúa con micropatrones APTMS, se forma una amida estable vínculo entre HA intermedios y amina primaria de ATPMS. Un ejemplo de HA superficie modelada visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia y un análisis ImageJ intensidad de fluorescencia demostrar la inmovilización con dibujos de HA se muestran (Figura 1B-C).
Las superficies HA micropatterned permitirá el estudio de las interacciones de célula de cáncer con HA expgenous. Tanto MDA-MB-231 materna y LS174T líneas celulares humanas de cáncer de colon preferentemente se adhieren a las regiones micropatterned HA (Figura 2). Imágenes de alta resolución mediante microscopía electrónica de barrido se puede utilizar para analizar las interacciones de las células cultivadas con superficies HA inmovilizado (Figura 3).
Figura 1 HA micropatterned superficies (A) Esquema que describe el desarrollo de superficies funcionales HA, (B) Imagen de fluorescencia de la fluoresceína (verde) de la etiqueta HA superficie micropatterned. (C) de píxeles 3D mapa de distribución utilizando el software ImageJ demostrando los patrones HA discretos. Barra de escala = 100μm. Modificado a partir de 9 con permiso de Elsevier.
Figura 2. Cáncer de adhesión celular en las superficies HA micropatterned. Ambos puntos (A) y de mama (B) carcinoma de preferencia conforme a los parches de HA con 24 horas de cultivo. Modificado a partir de 9 con permiso de Elsevier.
Figura 3. Interacción de las células del cáncer con HA. (A) Digitalización de imágenes de microscopía electrónica de las células de cáncer de colon (A) en las superficies cultivadas HA demostrado a bajo aumento (izquierda) y el gran aumento (derecha, de las plazas a la izquierda) y de las células de cáncer de mama (B) cultivadas en las superficies de HA se muestra a bajo aumento (izquierda) y el gran aumento (derecha, de los cuadrados de la izquierda).
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Discussion
El método presentado micropatterning HA permite el estudio de las interacciones celulares con exógenos HA. HA se sabe que juega un papel clave en la progresión del cáncer 1, sin embargo ha habido pocos estudios investigando la interacción de las células cancerosas en dos dimensiones superficies HA patrón. Un estudio controlables en exógenos micropatrones HA de alta resolución permite la visualización de la adhesión de las células cancerosas, el crecimiento y la migración y puede aclarar aún más los fundamentos de cáncer.
Mediante la combinación de la química y la impresión por microcontacto carbodiimida, hemos desarrollado las superficies con patrones diferentes de HA para estudiar las interacciones de las células cancerosas. Este método permite que las superficies de forma consistente patrón compatible con el cultivo de células y las técnicas de análisis, incluyendo pero no limitado a la tinción de inmunofluorescencia, microscopía electrónica de barrido, la inhibición, la migración, etc
Además, las técnicas de fotolitografía permite la microfabricación fácil de cualquier modelo deseado, para controlar la inmovilización de HA para aplicaciones específicas. Por ejemplo, la fabricación de sellos de PDMS con franjas lineales que inmovilizar HA en una matriz lineal y podría ser útil en el análisis de la migración de células a lo largo de modelado HA.
A pesar de que han utilizado este método sobre todo para dilucidar las interacciones de las células cancerosas con HA, esta técnica es aplicable para estudiar las interacciones con otros tipos de células. Además, este método puede ser utilizado para inmovilizar a una amplia gama de moléculas de HA. La HA se han inmovilizado está marcado con fluorescencia, con un peso molecular de 800 kDa. Sin embargo, los rangos de HA en el tamaño de 2000 a 25000 unidades repetidas de disacáridos, y la respuesta celular se ha demostrado que depender de HA de peso molecular 10-11. Este protocolo por lo tanto, se puede aplicar a inmovilizar HA de diferentes pesos moleculares para investigar la respuesta celular a HA exógeno.
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Disclosures
Figura esquemática de vídeo reproducido con permiso; Derechos de Autor Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. La reconstrucción del nicho de diferenciación de las células madre embrionarias con biomateriales. Macromol. Biosci. 2010, 21 de octubre. [Epub ahead of print].
Acknowledgments
Los autores reconocen el uso del laboratorio de análisis de la superficie en la Universidad Johns Hopkins, financiado en el marco de la Investigación en Ciencias de Materiales e Ingeniería a través de la National Science Foundation. LED es un aprendiz de IGERT y un becario de la Fundación Nacional de Ciencias de Posgrado. Esta investigación fue financiada parcialmente por el NIH subvención U54CA143868.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
- Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
- Hamilton, S. R. The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells. Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).
- Götte, M., Yip, G. W. Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective. Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).
- Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response. Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).
- Barbucci, R. Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule. Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).
- Morra, M., Cassinelli, C. Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).
- Khademhosseini, A. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).
- Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells. Biomaterials. 28, 825-835 (2007).
- Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid. Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).
- Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).
- Slevin, M. Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways. Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).
