Summary
ومن المفهوم على نطاق واسع أن القوات الميكانيكية في الجسم يمكن أن تؤثر على تمايز الخلايا وانتشارها. هنا نقدم بروتوكول الفيديو مما يدل على استخدام مفاعل حيوي مبنية خصيصا لتقديم أحادي المحور سلالة الشد دوري للحد من الخلايا المستزرعة على ركائز micropatterned مرنة.
Abstract
تم توثيقه جيدا دور القوات الميكانيكية في تطوير وصيانة الأنسجة البيولوجية ، بما في ذلك العديد من الظواهر ينظم ميكانيكيا مثل إعادة تشكيل العظام ، وتضخم العضلات ، وسلس اللدونة الخلية العضلية. ومع ذلك ، فإن القوات المشاركة غالبا ما تكون معقدة وصعبة للغاية لمراقبة والتحكم في الجسم الحي. لأفضل تحقيق في تأثيرات القوى الميكانيكية على الخلايا ، طورنا في أسلوب المختبر لتطبيق أحادي المحور سلالة الشد دوري لخلايا ملتصقة مثقف على الأغشية المرنة. هذه الطريقة تستخدم مفاعل حيوي صمم خصيصا مع نظام كام الدوار الآلية لتطبيق القوة المطلوبة. هنا نقدم بروتوكول الفيديو خطوة بخطوة تبين كيفية تجميع المكونات المختلفة لكل "غرفة تمتد" ، بما في ذلك ، في هذه الحالة ، وهي غشاء السيليكون مع تضاريس micropatterned لخلايا مع اتجاه توجيه السلالة. وصفنا أيضا إجراءات لتعقيم الغرف ، على بذر خلايا الغشاء ، الإغلاق للغرفة في مفاعل حيوي ، وضبط المعلمات الميكانيكية (أي حجم ومعدل سلالة). للإجراءات المبينة في هذا البروتوكول خاصة محددة لبذر خلايا الجذعية الوسيطة على أغشية السيليكون مع قنوات واسعة 10 ميكرومتر الموجهة موازية لاتجاه الضغط. ومع ذلك ، فإن الأساليب والمواد التي تم عرضها في هذا النظام هي مرنة بما يكفي لاستيعاب عدد من الاختلافات حول هذا الموضوع : معدل الضغط وحجمه ومدته ونوع من الخلايا ، والطوبوغرافيا غشاء ، غشاء الطلاء ، ويمكن أن تصمم جميع الموجودين إلى التطبيق المطلوب أو النتيجة. هذا هو أسلوب قوي للتحقيق في آثار سلالة الشد أحادي المحور تطبيقها على الخلايا في المختبر.
Protocol
0 يوم -- التعقيم قبل يوم من التجربة
- وضع المواد في الحوض البلاستيك وتعقيم مع الكحول 70 ٪ لمدة 2 ساعة :
- الغرف
- الأغطية
- الإطارات (جميع القطع 3)
- مسامير
- جوانات المطاط
- ملقط
- مقص
- عرافة الشدات
- تنظيف الأغشية Aquet بالصابون والماء المقطر.
- الأغشية يصوتن في الكحول 70 ٪ لمدة 10 دقيقة.
- مكان الأغشية نظيفة في أطباق بلاستيكية مربعة. إذا باستخدام الأغشية منقوشة ، وضمان أن الجانب هو نمط مواجهة (رش الكحول على جانب واحد من الغشاء ومراقبة السائل لتشغيل أسفل الأخاديد).
- ترك الأغشية غطت في الكحول 70 ٪ لمدة 2 ساعة.
- قفازات في حزمة رقائق الألومنيوم للالتعقيم صباح الغد.
- جعل 2 ٪ (الوزن / الحجم) الجيلاتين الحل (2g/100mL) في الماء المقطر لالتعقيم غدا.
- بعد التعقيم 2 ساعة في الكحول 70 ٪ ، وإخضاع جميع المواد البوليمر والأغشية (غير autoclavable المواد) في غطاء محرك السيارة ليلا فوق البنفسجية :
- الغرف
- الأغطية
- الإطارات (جميع القطع 3)
- الأغشية
- حزمة المواد المتبقية في حقيبة autoclavable :
- مسامير
- جوانات المطاط
- ملقط
- مقص
- عرافة الشدات
اليوم 1 -- جمعية غرف تمتد
- الأوتوكلاف ملقط ، مقص ، والشدات عرافة ، ومسامير ، والحشايا ، والقفازات ، والجيلاتين باستخدام الأوتوكلاف صغير في 240 درجة فهرنهايت لمدة 20 دقيقة مجموع
- إزالة الأغشية من الأشعة فوق البنفسجية وعلاج مع O 2 البلازما (الجانب منقوشة فوق) لمدة دقيقة 1 ~.
- في هود TC ، وتغطي منطقة منقوشة الأغشية البلازما تعامل مع الجيلاتين. معطف 30 دقائق تحت أشعة فوق البنفسجية.
- يغسل كل غشاء 2X مع برنامج تلفزيوني. بعد غسل 2 ، وترك بعض PBS على الأغشية لابقائهم زلق ، لتسهيل عملية التجميع في المجلسين. (يجب أيضا استخدام هذه PBS لتليين جوانات لتسهيل التجميع).
- تجميع الأغشية إلى غرف (ارتداء القفازات تعقيمها أثناء التجمع)
- ربط قطعتين من الإطار الرئيسي باستخدام برغي واحد.
- الوجه الإطار أكثر من مكان وغشاء على أعلى بحيث تواجه الجانب الجيلاتين مغلف بالمطاط باتجاه الإطار (منطقة منقوشة يجب أن تكون في الوسط).
- تأمين غشاء إلى الإطار باستخدام طوقا على كل جانب.
- اضغط على حشيات في ، باستخدام طيف ، وحتى الضغط ، حتى لا تمزق الغشاء.
- نعلق الإطار تجميعها لتي بار.
- الوجه الإطار ومكان في الغرفة رأسا على عقب. الأشعة فوق البنفسجية الجانب الخلفي من الإطار ، وغشاء لمدة 30 دقيقة
- الوجه الإطار مرة أخرى ، والمسمار في غرف (أي تغيير لغرفة التحكم ، ولكن لغرفة تمتد ، والحاجة إلى استخدام اثنين من المسامير لنعلق قطعة نهاية الإطار إلى الجزء السفلي من الغرفة ، وتحتاج إلى إزالة المسمار واحد هو عقد قطعتين من الإطار معا). الجانب الأمامي للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. تأكد من الأغشية جافة تماما قبل الشروع في الخطوة التالية ، وإلا فإن الحل الخلية قد خلع أثناء البذر.
- بذور الخلايا. مساحة المنطقة = 1 صفيحة من 3 الأغشية ، وذلك باستخدام 1 / 3 من لوحة متكدسة في الغشاء. استخدم 1 مل من محلول الخلية في الغشاء. وأكثر من أي 1.5mL يكون من الصعب إبقاء على حل. وضع حل الخلية فقط على منطقة منقوشة ، واستخدام غيض ماصة لنشر الحل حولها. تغطية الدوائر وترك الخلايا نعلق لمدة 30 دقيقة RT في غطاء محرك السيارة.
- الانتقال إلى غرف وترك الخلايا الحاضنة لمدة ساعة 1 نعلق أكثر من ذلك. كن حذرا جدا تتحرك الدوائر لتجنب ترك حل الخلية زلة قبالة! وسوف يدمر الخلايا في تلك الدائرة ، إذا كان الحل يقع قبالة عند هذه النقطة.
- العودة إلى غرفة هود وإضافة وسائل الاعلام مل 20.
- غرف مكان في الحوض الكحول التي يتم تنظيفها مغطاة رقائق الألومنيوم (رش أيضا مع الكحول). تحرك الغرف لتمتد الحاضنة (10 ٪ CO 2).
- تأمين غرف تمتد إلى الجهاز. دعونا نولي المزيد من الخلايا بين عشية وضحاها ، وتمتد على البدء في اليوم التالي. (ملاحظة : عند وضع الجهاز في غرف تمتد ، وتذكر لقفل الجهاز في وضع "صفر" قبل ان يضع الدوائر ، ومن ثم إحكام الطوق المطاطي حول التروس لا تنسى لفتح التروس قبل البدء في الجهاز).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بانيس وآخرون. وذكرت لأول مرة استخدام نظام لتحفيز الميكانيكية للخلايا في المختبر باستخدام الركيزة مطاطية مرنة لتوفير القوة الميكانيكية للخلايا 1. منذ هذا الوقت ، وقد تم وضع تصور العديد من الاختلافات على هذا التصميم والاستفادة منها. تمتد عدة أنظمة ميكانيكية متاحة تجاريا تحت اسم "Flexercell" (Flexcell شركة الدولية) ، في حين أن بعض المعامل استخدام مبنية خصيصا الأجهزة. في هذا البروتوكول الفيديو وصفنا الإعداد واستخدام جهاز واحد من هذا القبيل في مختبرنا.
وقد استخدمت في بنائه حسب "آلة تمتد" يصور في هذا البروتوكول في مختلف الدراسات للتحقيق في آثار السلالة دوري أحادي المحور على أنواع مختلفة من الخلايا 2،3. هذا الجهاز هو جهاز متعدد الاستعمالات مع معلمات للتعديل عدة التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من الدراسات سلالة الميكانيكية. إعداد تصور هنا يمثل طريقة فريدة وقوية لتقديم أحادي المحور سلالة دوري لخلايا ملتصقة في الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
