Summary
İpliksi Orta serebral arter oklüzyonu farelerde iskemik inme eğitimi için ortak bir model.
Abstract
İnme, ölüm ve yetişkin sakatlık, özellikle çok gelişmiş ülkelerde en sık rastlanan nedenleri arasında yer almaktadır. Ancak, bugüne kadar tedavi seçenekleri çok sınırlı. Yeni terapötik yaklaşımlara ihtiyacı karşılamak için, deneysel inme araştırma, sık sık fokal serebral iskemi kemirgen modelleri kullanmaktadır. Çoğu araştırmacılar, fareler ya da sıçanlar orta serebral arter (MCA) kalıcı veya geçici oklüzyon kullanın.
Intraluminal sütür tekniği (Filament veya dikiş modeli olarak da adlandırılır) ile orta serebral arter (MCA) proksimal oklüzyon muhtemelen deneysel inme araştırmalarında en sık kullanılan model. Intraluminal MCAO model nispeten non-invaziv bir şekilde MCA topraklarının tekrarlanabilir geçici veya kalıcı iskemi inducing avantajı sunmaktadır. Intraluminal yaklaşımlar tüm topraklarının bu arter kan akışını keser. Filament oklüzyon böylece tutuklamalar, bazal ganglia kaynağı lenticulo-yivler arterler, proksimal akışı. Filament tekrarlanabilir lezyonlar korteks ve striatum MCA sonuçları tıkanıklığı ve kalıcı veya geçici olabilir. Buna karşılık, distal inducing modelleri (lenticulo yivler arterlerin dallanma) MCA oklüzyonu tipik striatum ve yedek neokorteks öncelikle dahil. Buna ek olarak bu modellerin kraniektomi gerektirir. Bu makale gösterilen model, bir silikon kaplı filament karotis artere tanıtıldı ve orta serebral arter kökenli bloklar Willis, Çember içine iç karotis arteri boyunca gelişmiş. Hastalarda, orta serebral arter oklüzyonlar iskemik inme en sık görülen nedenleri arasında yer almaktadır. Reperfüzyon sırasında noktası bağlı olarak iskemik lezyonların şiddeti değişen derecelerde olabilir, bu modelde değişik iskemik aralıklarla serbestçe seçilmiş olabilir bu yana. Kan akışının kısmen tromboembolik insanlarda pıhtı kendiliğinden veya tedavi (tPA) Parçalama işleminden sonra restorasyon modelleri en azından kapatılmasıy filament kaldırılması Reperfüzyon.
Bu video temel tekniğinin yanı sıra, bu modelin prediktif değeri sınırı en büyük tuzaklar ve karışıklıklar sunacak.
Protocol
Yüksek kaliteli ve tekrarlanabilirlik garanti etmek için, Standart Çalışma Prosedürleri (SOP) kullanmanızı tavsiye ederiz. Bu video, laboratuvarda özel olarak geliştirilen ve kullanılan yayınlanan SOP uygulanır . 1
1. Orta Serebral Arter Tıkanıklığı
- Fareler, veteriner personel ile istişarede uygun bir anestezi rejimi ile anestezi . (Örnek: indüksiyon 1.5 - 1.0 ile% 2 İsofluranın ve bakım - 2 / 3 N2O ve bir buharlaştırıcı kullanarak 1 / 3 O2 İsofluranın% 1.5).
- Farelerin Vücut sıcaklığı 36,5 ° C ± 0.5 ° C ısıtma plakası ile ameliyat sırasında korunur. Fare rektal sıcaklık göre ısıtan bir geri besleme kontrollü bir ısıtma yastığı, şiddetle tavsiye edilir.
- Deri ve kürk çevredeki uygun bir ajan (örneğin% 70 etil alkol) ile dezenfekte edin ve daha sonra kurulayın.
- Bir orta hat boyun insizyonu yapılır ve yumuşak dokuların dışında çekti.
- Sol karotis arter (LCCA) dikkatle çevresindeki sinirler (vagus siniri zarar vermeden) ve ligatür 6.0/7.0 dize kullanılarak yapılır disseke edilir. 5.0 dize de kullanılabilir.
- Sol eksternal karotis arter (Leça) sonra ayrılır ve ikinci bir düğüm yapılır.
- Sonra, sol internal karotid arter (Lica) izole edilir ve bir düğüm bir filament 6.0 ile hazırlanmıştır.
- Sol internal karotid arter (Lica) ve sol pterigopalatin arter (LPA) iyi bir görüş aldıktan sonra, hem de arterlerde mikrovasküler klip kullanarak kırpılır.
- Leca ve Lica çatallanmasıdır önce küçük bir delik LCCA kesilir. Silikon sertleştirici karışımı (aşağıya bakınız) ile kaplı 8.0 naylondan yapılmış bir monofilament klibi durana kadar sonra, Lica tanıtıldı. Dikkat oksipital arter girmek için ödenecek. (Şekil 1)
- Filament Willis daire LMCA kökeni kapamak için Lica takılı iken kırpılır arterler açıldı.
- Lica üçüncü düğüm filament konumunu düzeltmek için kapalıdır.
- Fareler hacim ikmal olarak subkutan 0,5 mL salin alırsınız. Ağrı kesici, Lidokain jel topikal yara uygulanır.
- Reperfüzyon amaçlanan ise, fareler için 30 kalır ısıtılmış bir kafes içinde 90 dakika oklüzyon, yara küçük bir dikiş klip ile kapalı olabilir. Daha sonra, ikinci bir anestezi yapılır, ICA üçüncü düğüm anlık açılan ve filament geri.
- Kalan dikişler kısaltılmış ve deri cerrahi sütür ile uyarlanmıştır.
- Tüm hayvanlar, yukarıda açıklandığı gibi ikinci bir birim ikmal alırsınız.
- Hayvanlar vücut ısısını kontrol etmek için iki saat boyunca ısıtmalı bir kafese konur.
- Hayvanların rahatsızlık belirtileri için ameliyat sonrası günlük olarak kontrol edilmelidir. Fareler bazı cerrahi sonrası kilo kaybı gösterebilir. Onlar yeme teşvik etmek için zemin üzerine yerleştirilen bir petri-çanak püresi gıda alırsınız. Yemek yedi gün boyunca günlük olarak değiştirilir.
2. Şam Operasyonu
- Sahte işlemler için filament LMCA kapamak için yerleştirilir ve anında reperfüzyon (1.8) izin hemen geri çekilir. Ikinci bir anestezi de dahil olmak üzere daha sonraki çalışma serebral iskemi (1.14 1.9) gören hayvanlar üzerinde yapılan aynıdır.
3. Filament hazırlanması
- Filament Sterilite düşünülmelidir. Sterilize filament yanı sıra, uygun bir işleme ekipman kullanımı daha sonra steril bir cerrahi için bir ön koşuldur. Filament Dezenfeksiyon, zor, birçok ortak sterilizasyon yöntemleri filament kalite kötüleştirebilir. Ancak, radyasyon gibi yöntemlerle, UV ışık veya γ ışınları, veya kimyasal sterilizasyon örneğin, örneğin, etilen oksit gibi yüksek reaktif gazlar ile uygulanabilir.
- 8.0 naylon filament mikroskop altında 11 mm uzunluğa bölünür
- Filament ucu Xantopren M Mukoza ve aktivatör NF Optosil sertleştirici karışımı ile 8 mm uzunluğu boyunca tamamen ve eşit şekilde kaplanmış olmalıdır
4. Temsilcisi Sonuçlar
Kan akımı kısıtlaması süresine bağlı olarak, farklı motor ve davranışsal açıkları sonucu,. Her ikisi de 30 ve 60 dk serebral iskemi, sonra hayvanların çoğu durumda yanal itme azalmış direnç göstermek ve hareketlilik içinde rahatsızlık nedeniyle çizerek. Daha hafif lezyonlar ön li bir fleksör pozisyon olarak tezahürmbs. Bu kolayca gözlemlenebilir işaretler operasyonun başarısı için temel bir puan olarak kullanılabilir. 2
Morfolojik lezyon histoloji veya Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI) kullanılarak değerlendirilebilir. Orta serebral arter tıkanıklığı Altmış dakika, 30 dakika iskemi striatum sınırlı esas nöronal hücre ölümüne neden ise doku pannecrosis striatum ve neokorteks de dahil olmak üzere bir alan üretir. 3 (Şekil 2) infarkt hacmi açısından, biz bekliyoruz bir standart sapma bir dizi operasyon% 30 daha düşüktür. 60 dakika sonra% 20 - Ölüm 30 iskemi ve 10 dakika sonra yaklaşık% 5 ile kapama süresi bağlıdır.
Diğer minimal invaziv olasılık başarısını doğrudan bir kontrolü sağlayan işlem sırasında lazer Doppler flowmetre (LDF) kullanımı. Bir bireysel hayvan, 10 azalma - preocclusion değerleri% 20 fokal serebral iskemi başarılı indüksiyon açıkça gösterir 4 Ancak, LDF kişiler arası karşılaştırmalar yöntemi olarak kullanılır olması değil., LDF sadece kan nicel değişiklikler (yüzde olarak) ölçmek. Beri. küçük ve sınırlı bir doku örneği hacmi içinde akar. Bu kan akımını azaltma mekansal boyutları hakkında bilgi vermez. 5
Yürüme analizi 6,7, Rotarod 8, kutup testi 9,10, yapışkan kaldırma testi 11,12, merdiven testi 13,14, 15,16 merdiven basamak testi ve Morris su labirenti de dahil olmak üzere, inme sonrası davranışsal yönlerini değerlendirmek için çeşitli testler vardır 17. Tüm bu testler, MCAo için maruz kalan farelerde kontrol hayvanlarına göre daha az başarılı bir şekilde gerçekleştirin.
Şekil 1 fare beyin (arka plan tasvir) besleyen damar mimari Programı. Farklı suşlar değişkenlik gösterir, örneğin oksipital arter bazen internal karotid arter bırakır.
Şekil 2. Tipik lezyon boyutları proksimal MCAo modelinde reperfüzyon farklı bir zaman geçtikten sonra şematik gösterimi. Ortasında, fonksiyonel aktivite ve MCAo sonra serebral kan akımı tipik seyri tasvir edilmektedir. (MCAo: Orta serebral arter tıkanıklığı, LDF: Lazer Doppler akım ölçümü)
Discussion
Geçici, proksimal MCA oklüzyonu 18,19 modeli hastalarda iskemik inme en yaygın türlerinden biri taklit sundu. Değişken reperfüzyon kez 20 modeli büyük geçici iskemik atak (TIA) kadar hasar farklı sınıflarda iskemik yarımkürenin büyük parçalar da dahil olmak üzere infarktlar. Bu vuruş sonra araştırmacı farklı patofizyolojik mekanizmalar çalışma sağlar. 20,21
Cerrahi kısa bir süre içinde gerçekleştirilir ve yüksek tekrarlanabilir lezyonlar olabilir. Bununla birlikte, bu karışıklıklar tam bir kontrolü gerektirir. Operasyon tekniği 22 küçük farklılıklar infarkt farklı etkileri hesaba olabilir. 23,24 Ayrıca, serebral vasküler anatomi sapmaların nedeniyle, farklı fare suşları farklı bir sonuç göstermektedir. 25,26 Vücut sıcaklık, nörolojik hasar hipotermi daha ciddi eksiklikler küçük lezyonların 27 ve hipertermi önde gelen etkiler. Buna göre 28, sıcaklık kontrolü ve bakımı, bu modelde son derece alakalı. Buna ek olarak, kan basıncı ve kan gazları 29 sonuç önemli karışıklıklar ve izlenecektir. 30,31 hızlı ve minimal invaziv yöntemler kullanmak (non-invaziv uygun kan basıncı ölçümü ve kolay erişilebilir bir kan toplama sitelerine) tavsiye edilir. Anestezik seçim İsofluranın örneğin bazı nöroprotektif etkileri ve / veya vazodilatörler olması gibi, aynı zamanda son derece önemlidir. Sonuç olarak 32, anestezi maruz kalma, mümkün ve standart olarak kısa olmalıdır . 15 dakika daha uzun ameliyatı geçirmiş hayvanlar dahil değildir.
Cerrahi sitesi Tıraş microabrasions ve inflamasyon üretir ve saç parçaları bültenleri. Bu da iltihabı artırabilir ve lokal enfeksiyon, inme patofizyolojisinde etkisi olabilir teşvik olabilir. Konut koşulları, özellikle zenginleştirme kullanımı, inme sonucu etkileyebilir ve standardize edilmiş ve araştırma raporları açıklanan olmalıdır. 6,33,34 tekrarlanabilirlik çevresel zenginleştirme ve etkisi kullanılması tartışma konusudur. 35 Bir başka önemli karıştırıcı özellikle iskemi (36) uzun zamanlar sonra enfeksiyon indüklenen inme riski, hangi ek morbidite ve artmış mortalite açar. 37,38 enfeksiyonları 5 gün yaklaşık 3 semptomatik hale geldikçe, bu tür modeller takip uzun vadeli önemli sonuçları vardır.
Inme, standardizasyon ve kalite kontrolü için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için ilgili üretmek için preklinik translasyonel inme araştırmalarında son derece önemlidir 39 "İyi Laboratuar Uygulamaları" 40,41 zorunlu kılmaktadır.
- kullanılan hayvanların uygun ve detaylı bir tanımı;
- örneklem büyüklüğü beklenen etki büyüklüğü hesaplanması ve raporlanması;
- içerme ve dışlama kriterleri, çalışma öncesi;
- gruplar halinde tahsisi randomizasyon;
- araştırmacılara göre dağılımı gizlenmesi;
- analizin dışında hayvanların raporlama;
- sonucu kör değerlendirmesi;
- ilgi ve çalışma fonları potansiyel çatışmalar raporlama.
Disclosures
Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Almanya tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bu çalışma hibe anlaşması n ° 201.024 ve n ° 202.213 (Avrupa İnme Network) kapsamında Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) tarafından finanse edildi. Ek finansman Bundesministerium für Bildung und Forschung (Stroke Araştırma Berlin Merkezi) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NEUROCURE) tarafından verildi.
Yazarlar animasyon üretmek için çalışma ve Elke Ludwig (Charité Video Servisleri) Mareike Thielke (Deneysel Nöroloji Dep., Charite Berlin) sırasında destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical scissors (skin cut) | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Spring scissors (according to Vannas) | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Applying forceps for micro clamps | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Micro vascular clamp (e.g. S&G B1-V) | Fine Science Tools | 00396-01 | Also Serrefine possible |
| 2 Hemostats according to Hartmann | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Needle holder (according Olsen-Hegar or other) | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Standard anatomical forceps (for wound closure) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 5/0 sutures | Suprama | for vascular ligatures | |
| 6/0 sutures | Suprama | for skin suture, 5/0 also possible | |
| Lidocaine (e.g. Xylocain Gel 2%) | AstraZeneca | or other local pain relief | |
| Dissecting microscope (stereo microscope), magnification 6x to max. 40x | Leica Zeiss | MZ6 Stemi2000C | |
| Cold light source | Leica Microsystems | KL1500 | |
| Temperature feedback controlled heating pad system | Fine Science Tools | 21052-00 | With mouse pad and small probe |
| Anaethesia system for isoflurane | |||
| Isoflurane | Abott | ||
| Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 | Heated cage |
| 8.0 nylon filament | Suprama | TEL181005 | for coating |
| Scalpel | For cutting filament in pieces | ||
| Ruler | To cut correct length of filament | ||
| Xantopren M Mucosa | Heraeus Instruments | ||
| Activator Universal Plus | Heraeus Instruments | Optosil - Xantopren | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| A soft underlay for storing and grasping the uncoated filaments | e.g. swabs, foam, … | ||
| Receptacle for new build filaments | e.g. petri dish, flexible foam,… |
References
- Dirnagl, U. Members of the MCAO-SOP Group. Standard operating procedures (SOP) in experimental stroke research: SOP for middle cerebral artery occlusion in the mouse. Nature Precedings. , (2010).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
- Katchanov, J. Selective neuronal vulnerability following mild focal brain ischemia in the mouse. Brain Pathol. 13, 452-464 (2003).
- Dirnagl, U. Complexities, Confounders, and Challenges in Experimental Stroke Research: A checklist for researchers and reviewers in Rodent models of stroke. Dirnagl, U. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. 267-267 (2010).
- Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
- Wang, Y. A comprehensive analysis of gait impairment after experimental stroke and the therapeutic effect of environmental enrichment in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1936-1950 (2008).
- Lubjuhn, J. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184, 95-103 (2009).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20, 302-304 (1968).
- Matsuura, K., Kabuto, H., Makino, H., Ogawa, N. Pole test is a useful method for evaluating the mouse movement disorder caused by striatal dopamine depletion. J Neurosci Methods. 73, 45-48 (1997).
- Bouet, V. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203, 555-567 (2007).
- Freret, T. Delayed administration of deferoxamine reduces brain damage and promotes functional recovery after transient focal cerebral ischemia in the rat. Eur J Neurosci. 23, 1757-1765 (2006).
- Modo, M. Neurological sequelae and long-term behavioural assessment of rats with transient middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 104, 99-109 (2000).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 2-3 (1991).
- Baird, A. L., Meldrum, A., Dunnett, S. B. The staircase test of skilled reaching in mice. Brain Res Bull. 54, 243-250 (2001).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. J Neurosci Methods. 115, 169-179 (2002).
- Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. J Neurosci Methods. 153, 104-113 (2006).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11, 47-60 (1984).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Endres, M., Dirnagl, U. Neuroprotective Strategies in Animal and in vitro-Models of Neuronal Damage: Ischemia and Stroke. Molecular and Cellular Biology of Neuroprotection in the CNS. Alzheimer, C. , Kluver Academic and Landes Bioscience. New York. Vol. 513 455-474 (2003).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition). J Exp Stroke Transl Med. 2, 2-27 (2009).
- Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 174, 18-24 (2008).
- Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970, 1-2 (2003).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44, 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
- Florian, B. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438, 180-185 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349, 130-132 (2003).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35, 1720-1725 (2004).
- Shin, H. K. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39, 1548-1555 (2008).
- Bottiger, B. W. Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 65, 135-142 (1999).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
- Endres, M. Mechanisms of stroke protection by physical activity. Ann Neurol. 54, 582-590 (2003).
- Gertz, K. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99, 1132-1140 (2006).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Liesz, A. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia: immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40, 2849-2858 (2009).
- Meisel, C., Schwab, J. M., Prass, K., Meisel, A., Dirnagl, U. Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Nat Rev Neurosci. 6, 775-786 (2005).
- Engel, O., Meisel, A. Models of Infection Before and After Stroke: Investigating New Targets. Infect Disord Drug Targets. 9, (2010).
- Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1465-1478 (2006).
- Macleod, M. R. Good laboratory practice: preventing introduction of bias at the bench. Stroke. 40, 50-52 (2009).
- Group, S. T. A. I. R. Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development. Stroke. 30, 2752-2758 (1999).
