Summary
Filamentous Verschluss der mittleren Hirnarterie ist ein gemeinsames Modell für die Untersuchung einen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen.
Abstract
Der Schlaganfall ist eine der häufigsten Ursachen für Tod und Invalidität bei Erwachsenen, vor allem in den hoch entwickelten Ländern. Allerdings sind die Behandlungsmöglichkeiten bisher sehr begrenzt. Um den Bedarf an neuen Therapieansätzen, experimentellen Schlaganfall-Forschung häufig beschäftigt Nagermodellen fokaler zerebraler Ischämie. Die meisten Forscher nutzen dauerhafte oder vorübergehende Okklusion der mittleren zerebralen Arterie (MCA) in Mäusen oder Ratten.
Proximalen Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCA) über die intraluminale Nahttechnik (so genannte Filament oder Faden-Modell) ist wahrscheinlich die am häufigsten verwendete Modell in der experimentellen Schlaganfall-Forschung. Die intraluminale MCAO Modell bietet den Vorteil der Induktion reproduzierbare vorübergehende oder dauerhafte Ischämie der MCA Gebiet in einer relativ nicht-invasive Art und Weise. Intraluminale Ansätze unterbrechen die Durchblutung des gesamten Territoriums von dieser Arterie. Filament Okklusion damit Verhaftungen flow proximal des lenticulo-gestreifte Arterien, die den Basalganglien zu versorgen. Filament Verschluss der MCA Ergebnisse in reproduzierbaren Läsionen im Kortex und Striatum und kann entweder dauerhaft oder vorübergehend. Im Gegensatz dazu Modellen induzieren distalen (an der Verzweigung der lenticulo-gestreifte Arterien) MCA-Okklusion in der Regel ersparen das Striatum und in erster Linie um den Neocortex. Darüber hinaus sind diese Modelle erfordern Kraniektomie. In das Modell in diesem Artikel gezeigt, ist ein Silizium-beschichteten Faden, der in der Arteria carotis communis eingeführt und entlang der A. carotis interna in den Kreis der Willis, wo es blockiert den Ursprung der Arteria cerebri media. Bei Patienten, sind Verschlüsse der A. cerebri media zu den häufigsten Ursachen für einen ischämischen Schlaganfall. Da unterschiedliche ischämische Abständen frei in diesem Modell gewählt werden, je nach Zeitpunkt der Reperfusion, ischämische Läsionen, die mit unterschiedlichen Schweregraden hergestellt werden können. Reperfusion durch Entfernen der Okklusion Filament zumindest teilweise Modelle der Wiederherstellung der Durchblutung nach spontaner oder therapeutischer (tPA) Lyse einer thromboembolischen Blutgerinnsel in den Menschen.
In diesem Video stellen wir Ihnen die grundlegende Technik sowie die wichtigsten Fallstricke und Störfaktoren, die den prädiktiven Wert dieses Modells beschränken können.
Protocol
Um eine hohe Qualität und Reproduzierbarkeit, empfehlen wir die Verwendung von Standard Operating Procedures (SOP). In diesem Video werden veröffentlicht SOPs als entwickelt und in unserem Labor angewandt. 1
1. Middle Zerebralarterie
- Mäuse sind betäubt mit einem entsprechenden Betäubungsmittel Regime in Rücksprache mit Tierärzten. (ZB Induktion mit 1,5 bis 2% Isofluran und Wartung mit 1,0 bis 1,5% Isofluran in 2 / 3 N2O und 1 / 3 O2 mit einem Verdampfer).
- Die Körpertemperatur der Mäuse ist mit 36,5 ° C ± 0,5 ° C während der Operation mit einer Heizplatte gehalten. Ein Feedback-kontrollierte Heizkissen, die nach der rektalen Temperatur der Maus erwärmt, wird dringend empfohlen.
- Desinfizieren Sie die Haut und die umliegenden Fell mit einem geeigneten Mittel (zB 70% Ethylalkohol) und trocknen Sie ihn danach.
- Eine Mittellinie Hals Schnitt gemacht und die Weichteile sind auseinander gezogen.
- Die linke Arteria carotis communis (LCCA) wird vorsichtig frei präpariert aus den umliegenden Nerven (ohne Schädigung der Vagus-Nerv) und einer Ligatur erfolgt über 6.0/7.0 String. 5,0 String kann auch verwendet werden.
- Die linke A. carotis externa (LECA) wird dann abgetrennt und ein zweiter Knoten gemacht wird.
- Als nächstes wird die linke A. carotis interna (LICA) isoliert und ein Knoten ist mit einem 6,0 Wendel vorbereitet.
- Nach Erhalt einer guten Ansicht der linken Arteria carotis interna (LICA) und die linke pterygopalatina Arterie (LPA), sind beide Arterien abgeschnitten, mit einem mikrovaskulären Clips.
- Ein kleines Loch ist in der LCCA geschnitten, bevor sie an die LECA und die LICA gabelt. Ein Monofilament von 8,0-Nylon mit Silizium-Härter-Gemisch (siehe unten) beschichtet wird dann in den LICA eingeführt, bis es an den Clip anhält. Ist darauf zu achten nicht auf die A. occipitalis einzugeben. (Abbildung 1)
- Der abgeschnittene Arterien sind geöffnet, während das Filament in die LICA eingeführt wird, um die Herkunft der LMCA in den Kreis der Willis verschließen.
- Der dritte Knoten auf der LICA geschlossen wird, um das Filament in Position zu fixieren.
- Die Mäuse erhalten Kochsalzlösung 0,5 ml subkutan als Volumen Nachschub. Zur Schmerzlinderung ist Lidocain-Gel topisch in die Wunde aufgetragen.
- Wenn Reperfusion soll, Mäuse für 30 bleiben - 90 min Okklusion in einem beheizten Käfig, konnte die Wunde mit einer kleinen Naht-Clip verschlossen werden. Danach eine zweite Betäubung durchgeführt wird, ist der dritte Knoten auf der ICA momentanen geöffnet und der Faden zurückgezogen.
- Die restlichen Nähte werden verkürzt und die Haut mit einer chirurgischen Naht adaptiert.
- Alle Tiere erhalten einen zweiten Band Nachschub wie oben beschrieben.
- Die Tiere werden in einem beheizten Käfig für zwei Stunden gesetzt, um die Körpertemperatur zu kontrollieren.
- Die Tiere müssen täglich nach der Operation für Anzeichen von Beschwerden überprüft werden. Die Mäuse konnten zeigen einige postoperative Gewichtsabnahme. Sie erhalten pürierte Nahrung in einer Petrischale auf den Boden zu ermutigen, zu essen gegeben. Das Essen wird täglich für sieben Tage ersetzt.
2. Sham Betrieb
- Für Schein-Operationen der Faden eingelegt, um LMCA verschließen und sofort Instant Reperfusion (1,8) ermöglichen zurückgezogen. Die anschließende Operation ist identisch mit der auf die Tiere unterzogen zerebrale Ischämie (1,9-1,14) durchgeführt, einschließlich einer zweiten Narkose.
3. Vorbereitung der Filament
- Die Sterilität der Faden sollte in Betracht gezogen werden. Die Verwendung von sterilisierten Geräten sowie eine angemessene Behandlung des Filaments danach ist eine Voraussetzung für eine sterile Operation. Desinfektion des Filaments ist schwierig, da viele der gängigen Sterilisationsverfahren, die Qualität des Fadens verschlimmern kann. Allerdings Methoden wie Strahlung, zum Beispiel mit UV-Licht oder γ-Strahlen oder chemische Sterilisation, z. B. mit hoch reaktiven Gasen wie Ethylenoxid, anwendbar sind.
- 8,0 Nylonfaden ist in Längen von 11 mm unter dem Mikroskop geschnitten
- Das Filament Spitze muss vollständig und gleichmäßig über eine Länge von 8 mm beschichtet werden mit einem Härter Mischung aus Xantopren M Mucosa und Activator NF Optosil
4. Repräsentative Ergebnisse
Je nach Dauer des Blutflusses Einschränkung, verschiedene Motor-und Verhaltenswissenschaften Defizite führen. Sowohl nach 30 und 60 min von zerebraler Ischämie, Tiere in den meisten Fällen zeigen verringerte Widerstand gegen seitliche push und kreisenden aufgrund von Störungen in Fortbewegung. Milder Läsionen manifestieren als flexor Position in der vorderen limbs. Diese leicht zu beobachtenden Anzeichen kann als ein grundlegendes Ergebnis für den Erfolg der Operation verwendet. 2.
Morphologisch der Läsion kann unter Verwendung entweder Histologie oder Magnetic Resonance Imaging (MRI) werden. Sechzig Minuten Verschluss der mittleren Hirnarterie produziert Gewebe pannecrosis in einem Gebiet, darunter sowohl das Striatum und dem Neokortex, während 30 Minuten der Ischämie hauptsächlich neuronalen Zelltod begrenzt auf das Striatum verursachen. 3 (Abbildung 2) In Bezug auf Infarktvolumen erwarten wir, dass einer Standardabweichung von weniger als 30% in eine Reihe von Operationen. Die Sterblichkeit ist abhängig von der Okklusion Zeit mit rund 5% nach 30 min der Ischämie und 10 bis 20% nach 60 min.
Ein weiterer minimal invasive Möglichkeit ist der Einsatz von Laser-Doppler-Flussmessung (LDF) während der Operation, die eine direkte Kontrolle über seinen Erfolg ermöglicht. In einem einzelnen Tier, Reduktion auf 10 bis 20% der preocclusion Werte zeigt deutlich erfolgreicher Induktion fokaler zerebraler Ischämie 4 Allerdings LDF nicht als eine Methode für interindividuelle Vergleiche verwendet werden, da LDF nur messen kann quantitative Veränderungen (in Prozent) des Blutes. flow in einem kleinen und begrenzten Gewebeprobe Volumen. Es gibt keine Informationen über die räumliche Ausdehnung der verminderte Durchblutung. 5
Es gibt mehrere Tests, um Verhaltensweisen nach einem Schlaganfall zu beurteilen, einschließlich Ganganalyse 6,7, Rotarod 8, Pole-Test 9,10, Klebstoff Entfernung test 11,12, Treppenhaus-Test 13,14, Leitersprosse test 15,16 und Morris Water Maze 17. In all diesen Tests, Mäuse unterzogen MCAo weniger erfolgreich als die Kontrolltiere durchzuführen.
Abbildung 1. Scheme des Schiffes Architektur der hirnversorgenden (dargestellt im Hintergrund) in der Maus. Verschiedene Stämme können Abweichungen zeigen, zum Beispiel die A. occipitalis manchmal Blätter aus der Arteria carotis interna.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des typischen Läsion Größen nach verschiedenen Zeitpunkten der Reperfusion in der proximalen MCAo Modell. In der Mitte sind die typischen Verlauf der funktionellen Aktivität und der zerebralen Durchblutung nach MCAo dargestellt. (MCAo: Middle Zerebralarterie, LDF: Laser-Doppler-Messung)
Discussion
Das Modell der transienten, proximalen MCA-Okklusion 18,19 hier vorgestellten imitiert eine der häufigsten Arten von ischämischen Schlaganfällen bei Patienten. 20 Basierend auf variable Reperfusion mal, das Modell verschiedene Sorten von Schäden von transitorische ischämische Attacke (TIA), große Angebote Infarkte darunter große Teile der ischämischen Hemisphäre. Dies ermöglicht dem Forscher zu verschiedenen pathophysiologischen Mechanismen Studie nach einem Schlaganfall. 20,21
Die Operation kann in kurzer Zeit durchgeführt werden und produziert mit einer hohen reproduzierbaren Läsionen. Dennoch ist dies eine gründliche Kontrolle von Störfaktoren erfordert. 22 Kleine Unterschiede in der Bedienung Technik kann für unterschiedliche Auswirkungen auf die Infarkt-Konto. 23,24 Außerdem ist es aufgrund Varianzen in zerebrale vaskuläre Anatomie, zeigen verschiedene Mausstämme ein anderes Ergebnis. 25,26 Körper Temperatur wirkt sich neurologische Schäden, mit Hypothermie führt zu kleineren Läsionen 27 und Hyperthermie zu schweren Defiziten. 28 Folglich Temperaturregelung und Wartung ist sehr relevant in diesem Modell. 29 Darüber hinaus, Blutdruck und Blutgase wichtige Confounder des Ergebnisses werden und müssen überwacht werden. 30,31 Der Einsatz von schnellen und minimal invasive Methoden (nicht-invasive Blutdruckmessung, geeignete und leicht zugängliche Blutentnahme Sites) wird empfohlen. Die Wahl der Anästhesie ist auch sehr wichtig, da einige neuroprotektive Effekte haben können, und / oder Vasodilatatoren, wie zB Isofluran. 32 Daher sollte die Exposition auf die Anästhesie so kurz wie möglich und genormt. Wir schließen Tiere, die operiert wurden länger als 15 min.
Rasieren der chirurgischen Stelle produziert microabrasions und Entzündung und löst Haar-Fragmente. Dies kann weiter erhöhen Entzündungen und fördern lokale Infektion, die auf Schlaganfall Pathophysiologie auswirken können. Wohnverhältnisse, insbesondere die Verwendung von Bereicherung, kann sich auf Schlaganfall Ergebnis und sollten standardisiert und beschrieben in Research-Berichten. 6,33,34 Die Nutzung von Umweltressourcen Bereicherung und ihre Auswirkung auf die Reproduzierbarkeit ist eine Frage der Diskussion. 35 Ein weiterer wichtiger Confounder ist die Schlaganfall induziert Infektionsrisiko vor allem nach längeren Zeiten der Ischämie 36, was zu zusätzlichen Morbidität und erhöhter Mortalität führt. 37,38 Da Infektionen werden bei rund Tag 3 bis 5 symptomatisch, hat dies wichtige Konsequenzen für die langfristige Follow-up in solche Modelle.
Um zu Ergebnissen führen, die für die Entwicklung neuartiger Behandlungsmöglichkeiten für Schlaganfall, Standardisierung und Qualitätskontrolle ist sehr wichtig in der präklinischen Translational Stroke Research 39 "Good Laboratory Practice" 40,41 Mandate.:
- eine angemessene und detaillierte Beschreibung der verwendeten Tiere;
- Berechnung der Stichprobengröße und die Berichterstattung über den erwarteten Effekt Größe;
- Ein-und Ausschlusskriterien, die vor der Studie festgelegt;
- Randomisierung der Aufteilung in Gruppen;
- Zuteilungsverdeckung in Bezug auf die Ermittler;
- Berichterstattung Tiere aus der Analyse ausgeschlossen;
- geblendet Bewertung der Ergebnisse;
- Berichterstattung potentielle Interessenkonflikte und Studienfinanzierung.
Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her, indem Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlin, Deutschland gesetzt durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Europäischen Gemeinschaft Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. 201024 und Nr. 202213 (European Stroke Network) finanziert. Zusätzliche Mittel wurden vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (Centrum für Schlaganfall-Forschung Berlin) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NeuroCure) gegeben.
Die Autoren bedanken sich bei Mareike Thielke (Dep. für Experimentelle Neurologie, Charité Berlin) für die Unterstützung danken während der Operation und Elke Ludwig (Charité Video Services) für die Herstellung der Animation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical scissors (skin cut) | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Spring scissors (according to Vannas) | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Applying forceps for micro clamps | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Micro vascular clamp (e.g. S&G B1-V) | Fine Science Tools | 00396-01 | Also Serrefine possible |
| 2 Hemostats according to Hartmann | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Needle holder (according Olsen-Hegar or other) | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Standard anatomical forceps (for wound closure) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 5/0 sutures | Suprama | for vascular ligatures | |
| 6/0 sutures | Suprama | for skin suture, 5/0 also possible | |
| Lidocaine (e.g. Xylocain Gel 2%) | AstraZeneca | or other local pain relief | |
| Dissecting microscope (stereo microscope), magnification 6x to max. 40x | Leica Zeiss | MZ6 Stemi2000C | |
| Cold light source | Leica Microsystems | KL1500 | |
| Temperature feedback controlled heating pad system | Fine Science Tools | 21052-00 | With mouse pad and small probe |
| Anaethesia system for isoflurane | |||
| Isoflurane | Abott | ||
| Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 | Heated cage |
| 8.0 nylon filament | Suprama | TEL181005 | for coating |
| Scalpel | For cutting filament in pieces | ||
| Ruler | To cut correct length of filament | ||
| Xantopren M Mucosa | Heraeus Instruments | ||
| Activator Universal Plus | Heraeus Instruments | Optosil - Xantopren | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| A soft underlay for storing and grasping the uncoated filaments | e.g. swabs, foam, … | ||
| Receptacle for new build filaments | e.g. petri dish, flexible foam,… |
References
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