Summary
Filamenteuze occlusie van het Midden-cerebrale slagader is een gemeenschappelijk model voor het bestuderen van ischemische beroerte in muizen.
Abstract
Beroerte is een van de meest voorkomende oorzaken van sterfte en volwassen gehandicapten, met name in hoog ontwikkelde landen. Echter, de behandeling opties tot nu toe zijn zeer beperkt. Om te voldoen aan de behoefte aan nieuwe therapeutische benaderingen, experimenteel onderzoek beroerte heeft vaak knaagdiermodellen van focale cerebrale ischemie. De meeste onderzoekers gebruiken een permanente of tijdelijke occlusie van de midden cerebrale slagader (MCA) bij muizen of ratten.
Proximale occlusie van de midden cerebrale slagader (MCA) via de intraluminale hechting techniek (de zogenaamde filament of hechting model) is waarschijnlijk het meest gebruikte model in experimenteel onderzoek een beroerte. De intraluminale MCAO model biedt het voordeel dat het induceren van reproduceerbare tijdelijk of blijvend zijn ischemie van de MCA gebied in een relatief niet-invasieve manier. Intraluminale benaderingen onderbreekt de doorbloeding van het gehele grondgebied van deze slagader. Filament occlusie dus arrestaties vloeien proximaal van de lenticulo-gestreept slagaders, waardoor de basale ganglia leveren. Filament occlusie van de MCA resulteert in een reproduceerbaar laesies in de cortex en het striatum en kunnen permanent of van voorbijgaande aard. In tegenstelling, modellen inducerende distaal (aan de vertakking van de lenticulo-gestreept slagaders) MCA occlusie meestal sparen het striatum en in de eerste plaats betrekking op de neocortex. Naast deze modellen vereisen craniectomy. In het model gedemonstreerd in dit artikel, is een siliconen coating filament geïntroduceerd in de gemeenschappelijke halsslagader en geavanceerde langs de interne halsslagader in de Cirkel van Willis, waar het blokkeert de oorsprong van de midden cerebrale slagader. Bij patiënten, occlusies van de middelste cerebrale slagader behoren tot de meest voorkomende oorzaken van ischemische beroerte. Omdat verschillende ischemische intervallen kunnen vrij gekozen worden in dit model, afhankelijk van het tijdstip van de reperfusie, ischemische letsels met een verschillende mate van ernst kan worden geproduceerd. Reperfusie door verwijdering van de afsluitende gloeidraad ten minste gedeeltelijk de restauratie van de bloedstroom modellen na een spontane of therapeutische (tPA) lysis van een trombo-embolische stolsel bij de mens.
In deze video presenteren we de basistechniek, alsmede de belangrijkste valkuilen en confounders die de voorspellende waarde van dit model kan beperken.
Protocol
Ter waarborging van een hoge kwaliteit en reproduceerbaarheid, adviseren wij het gebruik van de Standard Operating Procedures (SOP). In deze video worden gepubliceerd SOP's zoals ontwikkeld en gebruikt worden in ons laboratorium toegepast. 1
1. Midden cerebrale slagader Occlusion
- Muizen worden verdoofd met een geschikt anesthetisch regime in overleg met het diergeneeskundig personeel. (Bijvoorbeeld inductie met 1,5 - 2% Isofluraan en onderhoud met 1,0 - 1,5% Isofluraan in 2 / 3 N2O en 1 / 3 O2 met behulp van een vaporizer).
- Lichaamstemperatuur van de muizen wordt gehandhaafd op 36,5 ° C ± 0,5 ° C tijdens een operatie met een verwarmingsplaat. Een feedback geregelde verwarming pad, die verwarmt op basis van de rectale temperatuur van de muis, wordt sterk aanbevolen.
- Ontsmet de huid en de omliggende vacht met een geschikt middel (bv 70% ethyl alcohol) en daarna drogen.
- Een middellijn hals incisie wordt gemaakt en het zachte weefsel uit elkaar worden getrokken.
- De linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA) wordt zorgvuldig ontleed vrij van de omringende zenuwen (zonder afbreuk te doen aan de nervus vagus) en een ligatuur wordt gemaakt met behulp van 6.0/7.0 string. 5.0 string kan ook worden gebruikt.
- De linker externe halsslagader (Leca) is dan gescheiden en een tweede knoop wordt gemaakt.
- Vervolgens wordt de linker interne halsslagader (LICA) geïsoleerd en een knoop is bereid met een 6,0 gloeidraad.
- Na het behalen van goed zicht op de linker interne halsslagader (LICA) en de linker pterygopalatine slagader (LPA), zijn beide slagaders geknipt, met behulp van een microvasculaire clip.
- Een klein gaatje is geknipt in de LCCA voordat het splitst naar de Leca en het LICA. Een monofilament gemaakt van 8,0 nylon gecoat met siliconen harder mengsel (zie onder) wordt vervolgens in het LICA, totdat hij stopt bij de clip. Aandacht moet worden betaald niet aan het achterhoofd slagader in te voeren. (Figuur 1)
- De geknipte slagaders worden geopend, terwijl de gloeidraad wordt ingevoegd in de LICA om de oorsprong van de LMCA af te sluiten in de cirkel van Willis.
- De derde knoop op de LICA is gesloten om de gloeidraad vast te stellen in positie.
- De muizen krijgen zoutoplossing 0,5 ml subcutaan, als het volume aanvullen. Voor de verlichting van de pijn, is Lidocaïne gel plaatselijk aangebracht in de wond.
- Als reperfusie is bestemd, muizen verblijf voor 30 - 90 min occlusie in een verwarmde kooi, kan de wond worden afgesloten met een kleine hechting clip. Daarna een tweede verdoving wordt uitgevoerd, de derde knoop op het ICA is kortstondig geopend en de gloeidraad ingetrokken.
- De overige hechtingen worden verkort en de huid is aangepast met een chirurgisch hechtdraad.
- Alle dieren krijgen een tweede volume replenishment zoals hierboven beschreven.
- Dieren worden in een verwarmde kooi voor twee uur te controleren voor de lichaamstemperatuur.
- De dieren moeten dagelijks worden gecontroleerd na een operatie op tekenen van ongemak. De muizen kon laten zien wat na de chirurgische gewichtsverlies. Zij ontvangen gepureerd voedsel in een petrischaal geplaatst op de vloer aan te moedigen eten. Het eten wordt dagelijks vervangen voor zeven dagen.
2. Sham Operation
- Voor sham de activiteiten van de gloeidraad wordt ingebracht om LMCA af te sluiten en onmiddellijk teruggetrokken tot instant reperfusie (1.8) mogelijk te maken. De latere werking is identiek aan die uitgevoerd op de dieren ondergaan cerebrale ischemie (+1,9 tot 1,14) inclusief een tweede verdoving.
3. Voorbereiding van de gloeidraad
- Steriliteit van de gloeidraad moet worden overwogen. Het gebruik van de gesteriliseerde apparatuur en een adequate behandeling van de gloeidraad is daarna een voorwaarde voor een steriele operatie. Desinfectie van de gloeidraad is moeilijk, omdat veel van de gemeenschappelijke sterilisatiemethoden kan verergeren van de kwaliteit van de gloeidraad. Maar methoden zoals bestraling, bijvoorbeeld met UV-licht of γ stralen of chemische sterilisatie, bijvoorbeeld met een zeer reactieve gassen zoals ethyleen oxide, van toepassing zijn.
- 8.0 nylon filament wordt gesneden in lengten van 11 mm onder de microscoop
- De gloeidraad tip moet volledig en gelijkmatig worden gecoat over een lengte van 8 mm met een verharder mengsel van Xantopren M slijmvlies en Activator NF Optosil
4. Representatieve resultaten
Afhankelijk van de duur van de bloedstroom beperking, verschillende motorische en gedragsproblemen tekorten resultaat. Zowel na 30 en 60 minuten van cerebrale ischemie, dieren in de meeste gevallen blijkt verminderde weerstand tegen zijdelingse duwen en cirkelen als gevolg van verstoring in beweging. Milder laesies zich manifesteren als een buigspier positie in de voorste limbs. Deze gemakkelijk waarneembare verschijnselen kan worden gebruikt als een basis score voor het succes van de operatie. 2
Morfologisch de laesie kan worden beoordeeld met behulp van histologie of Magnetic Resonance Imaging (MRI). Zestig minuten occlusie van de midden cerebrale slagader produceert weefsel pannecrosis in een gebied met inbegrip van zowel het striatum en de neocortex, terwijl 30 minuten van ischemie veroorzaken vooral neuronale celdood beperkt tot het striatum. 3 (figuur 2) In termen van infarct volume, verwachten we dat een standaarddeviatie lager is dan 30% in een reeks van operaties. Sterfte hangt af van de occlusie tijd met circa 5% na 30 min ischemie en 10 - 20% na 60 minuten.
Een andere minimaal invasieve mogelijkheid is het gebruik van Laser Doppler flowmetry (LDF) tijdens de operatie, die een directe controle van zijn succes mogelijk maakt. In een individueel dier, reductie tot 10 - 20% van de preocclusion waarden geeft duidelijk aan succesvolle inductie van focale cerebrale ischemie 4 Echter, LDF niet kan worden gebruikt als een methode voor het inter-vergelijkingen, want LDF kan alleen meten kwantitatieve veranderingen (in procenten) van bloed. stroom binnen een kleine en beperkte weefselmonster volume. Het geeft geen informatie over de ruimtelijke omvang van de verminderde doorbloeding van 5.
Er zijn verschillende tests om gedragsaspecten te beoordelen na een beroerte, inclusief ganganalyse 6,7, Rotarod 8, Pole-test 9,10, lijm verwijderen testen 11,12, trap-test 13,14, ladder trede te testen 15,16 en Morris water maze 17. In al deze tests, muizen blootgesteld aan MCAo presteren minder goed dan de controle dieren.
Figuur 1. Schema van het schip de architectuur die de hersenen (afgebeeld op de achtergrond) in de muis. Verschillende stammen kan blijken variaties, bijvoorbeeld het achterhoofd slagader bladeren soms van de interne halsslagader.
Figuur 2. Schematische weergave van de typische letsel maten na verschillende tijdstippen van reperfusie in de proximale MCAo model. In het midden, zijn de typische verloop van de functionele activiteit en cerebrale doorbloeding na MCAo afgebeeld. (MCAo: Midden-cerebrale slagader occlusie, LDF: Laser Doppler-meting)
Discussion
Het model van voorbijgaande aard, proximale MCA occlusie 18,19 hier gepresenteerde bootst een van de meest voorkomende vormen van ischemische beroerte bij patiënten. 20 op basis van variabele reperfusie tijden, het model verschillende soorten schade, variërend van transient ischaemic attack (TIA) naar grote aanbiedingen infarcten inclusief grote delen van de ischemische halfrond. Hierdoor kan de onderzoeker om te studeren verschillende pathofysiologische mechanismen na een beroerte. 20,21
Operatie kan worden uitgevoerd in een korte periode en produceert zeer reproduceerbare laesies. Toch is dit een grondige controle van de verstorende variabelen vereist. 22 Kleine verschillen in operatietechniek kan verantwoordelijk zijn voor verschillende effecten op het infarct. Bovendien 23,24, als gevolg van variaties in cerebrale vasculaire anatomie, verschillende muizenstammen laten een andere uitkomst. 25,26 Body temperatuur van invloed op neurologische schade, met hypothermie leidt tot kleinere laesies 27 en hyperthermie tot meer ernstige tekorten. 28 Daarom, temperatuur controle en onderhoud is van groot belang in dit model. 29 Bovendien, bloeddruk en gassen zijn belangrijke confounders van resultaat en de noodzaak om worden bewaakt. 30,31 Het gebruik van snelle en minimaal invasieve methoden (niet-invasieve bloeddrukmeting, geschikt en makkelijk toegankelijk bloedafname sites) wordt aanbevolen. De keuze van de narcose is ook zeer belangrijk, omdat sommigen hebben neuroprotectieve effecten, en / of vasodilatatoren, zoals bijvoorbeeld Isofluraan. 32 Daarom moet de blootstelling aan anesthesie worden zo kort mogelijk en gestandaardiseerd. We sluiten dieren die een operatie hebben ondergaan langer dan 15 minuten.
Het scheren van de operatiewond produceert microabrasions en ontsteking en geeft haar fragmenten. Dit kan verder toenemen ontsteking en stimuleren lokale infectie, die invloed kan hebben op een beroerte pathofysiologie. Huisvesting, in het bijzonder het gebruik van verrijking, kunnen van invloed zijn beroerte uitkomst en moeten worden gestandaardiseerd en beschreven in onderzoeksrapporten. 6,33,34 Het gebruik van milieu-verrijking en het effect ervan op de reproduceerbaarheid is een onderwerp van discussie. 35 Een andere belangrijke confounder is het beroerte verhoogd risico op infectie vooral na lange tijden van ischemie 36, wat leidt tot extra morbiditeit en een verhoogde mortaliteit. 37,38 als infecties worden symptomatisch rond dag 3 tot 5, heeft dit belangrijke gevolgen voor de lange termijn follow-up in dergelijke modellen.
Voor de productie van de resultaten relevant zijn voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën voor een beroerte, standaardisatie en kwaliteitsbewaking is zeer belangrijk in preklinisch translationeel onderzoek beroerte 39 "Good Laboratory Practice" 40,41 mandaten.:
- een passende en gedetailleerde beschrijving van de gebruikte dieren;
- steekproefgrootte berekening en rapportage over de verwachte omvang van het effect;
- inclusie en exclusie criteria, voordat het onderzoek vast te stellen;
- randomisatie van de toewijzing in groepen;
- blindering van de randomisatie met betrekking tot de onderzoekers;
- rapportage dieren uitgesloten van de analyse;
- geblindeerde beoordeling van de resultaten;
- rapportage potentiële belangenconflicten en studie financiering.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlijn, Duitsland set.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het zevende van de Europese Gemeenschap Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst n ° 201024 en nr. 202213 (European Stroke Network). Aanvullende financiering werd gegeven door de Bundesministerium für Bildung und Forschung (Centrum voor Onderzoek Stroke Berlijn), en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NEUROCURE).
De auteurs willen graag Mareike Thielke (Dep. voor Experimentele Neurologie, Charite Berlin) bedanken voor de steun tijdens de operatie en Elke Ludwig (Charite Video Services) voor de productie van de animatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical scissors (skin cut) | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Spring scissors (according to Vannas) | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Applying forceps for micro clamps | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Micro vascular clamp (e.g. S&G B1-V) | Fine Science Tools | 00396-01 | Also Serrefine possible |
| 2 Hemostats according to Hartmann | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Needle holder (according Olsen-Hegar or other) | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Standard anatomical forceps (for wound closure) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 5/0 sutures | Suprama | for vascular ligatures | |
| 6/0 sutures | Suprama | for skin suture, 5/0 also possible | |
| Lidocaine (e.g. Xylocain Gel 2%) | AstraZeneca | or other local pain relief | |
| Dissecting microscope (stereo microscope), magnification 6x to max. 40x | Leica Zeiss | MZ6 Stemi2000C | |
| Cold light source | Leica Microsystems | KL1500 | |
| Temperature feedback controlled heating pad system | Fine Science Tools | 21052-00 | With mouse pad and small probe |
| Anaethesia system for isoflurane | |||
| Isoflurane | Abott | ||
| Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 | Heated cage |
| 8.0 nylon filament | Suprama | TEL181005 | for coating |
| Scalpel | For cutting filament in pieces | ||
| Ruler | To cut correct length of filament | ||
| Xantopren M Mucosa | Heraeus Instruments | ||
| Activator Universal Plus | Heraeus Instruments | Optosil - Xantopren | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| A soft underlay for storing and grasping the uncoated filaments | e.g. swabs, foam, … | ||
| Receptacle for new build filaments | e.g. petri dish, flexible foam,… |
References
- Dirnagl, U. Members of the MCAO-SOP Group. Standard operating procedures (SOP) in experimental stroke research: SOP for middle cerebral artery occlusion in the mouse. Nature Precedings. , (2010).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
- Katchanov, J. Selective neuronal vulnerability following mild focal brain ischemia in the mouse. Brain Pathol. 13, 452-464 (2003).
- Dirnagl, U. Complexities, Confounders, and Challenges in Experimental Stroke Research: A checklist for researchers and reviewers in Rodent models of stroke. Dirnagl, U. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. 267-267 (2010).
- Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
- Wang, Y. A comprehensive analysis of gait impairment after experimental stroke and the therapeutic effect of environmental enrichment in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1936-1950 (2008).
- Lubjuhn, J. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184, 95-103 (2009).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20, 302-304 (1968).
- Matsuura, K., Kabuto, H., Makino, H., Ogawa, N. Pole test is a useful method for evaluating the mouse movement disorder caused by striatal dopamine depletion. J Neurosci Methods. 73, 45-48 (1997).
- Bouet, V. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203, 555-567 (2007).
- Freret, T. Delayed administration of deferoxamine reduces brain damage and promotes functional recovery after transient focal cerebral ischemia in the rat. Eur J Neurosci. 23, 1757-1765 (2006).
- Modo, M. Neurological sequelae and long-term behavioural assessment of rats with transient middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 104, 99-109 (2000).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 2-3 (1991).
- Baird, A. L., Meldrum, A., Dunnett, S. B. The staircase test of skilled reaching in mice. Brain Res Bull. 54, 243-250 (2001).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. J Neurosci Methods. 115, 169-179 (2002).
- Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. J Neurosci Methods. 153, 104-113 (2006).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11, 47-60 (1984).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Endres, M., Dirnagl, U. Neuroprotective Strategies in Animal and in vitro-Models of Neuronal Damage: Ischemia and Stroke. Molecular and Cellular Biology of Neuroprotection in the CNS. Alzheimer, C. , Kluver Academic and Landes Bioscience. New York. Vol. 513 455-474 (2003).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition). J Exp Stroke Transl Med. 2, 2-27 (2009).
- Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 174, 18-24 (2008).
- Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970, 1-2 (2003).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44, 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
- Florian, B. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438, 180-185 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349, 130-132 (2003).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35, 1720-1725 (2004).
- Shin, H. K. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39, 1548-1555 (2008).
- Bottiger, B. W. Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 65, 135-142 (1999).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
- Endres, M. Mechanisms of stroke protection by physical activity. Ann Neurol. 54, 582-590 (2003).
- Gertz, K. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99, 1132-1140 (2006).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Liesz, A. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia: immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40, 2849-2858 (2009).
- Meisel, C., Schwab, J. M., Prass, K., Meisel, A., Dirnagl, U. Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Nat Rev Neurosci. 6, 775-786 (2005).
- Engel, O., Meisel, A. Models of Infection Before and After Stroke: Investigating New Targets. Infect Disord Drug Targets. 9, (2010).
- Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1465-1478 (2006).
- Macleod, M. R. Good laboratory practice: preventing introduction of bias at the bench. Stroke. 40, 50-52 (2009).
- Group, S. T. A. I. R. Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development. Stroke. 30, 2752-2758 (1999).
