Summary
丝状的大脑中动脉闭塞,是一个研究小鼠缺血性中风的常见模型。
Abstract
中风是之间的死亡和残疾成人,尤其是在高度发达的国家,最常见的原因。然而,迄今为止的治疗方案是非常有限的的。为了满足新的治疗方法需要,中风的实验研究经常采用局灶性脑缺血啮齿动物模型。大多数研究人员使用的小鼠或大鼠大脑中动脉(MCA)的永久或暂时闭塞。
通过腔内缝合技术(所谓长丝或缝合模型)(MCA)的大脑中动脉近端闭塞可能是实验性中风的研究中最常用的模型。腔内MCAO模型提供了在一个相对非侵入性的方式重现短暂或永久MCA的领土缺血诱导的优势。腔内的方法中断的整个领土的这个动脉的血流量。因此,长丝闭塞逮捕流近端lenticulo纹动脉,供应基底节。长丝闭塞,在皮层和纹状体的重现性病变MCA的结果可以是永久或短暂。相比之下,MCA闭塞模型,诱导远端(lenticulo纹动脉分支)通常备用纹状体和主要涉及的大脑皮层。此外,这些模型需要去骨瓣。本文演示模型,硅涂层长丝引入左颈总动脉和先进的威利斯,它阻断大脑中动脉的起源圈沿颈内动脉。大脑中动脉闭塞的患者,是缺血性中风的最常见的原因。由于不同缺血时间间隔可自由选择在这个模型再灌注时间点上,可以产生不同程度的缺血性病变。再灌注去除咬合长丝至少部分模型自发或治疗(TPA)在人类的血栓栓塞血块溶解后恢复血液流动。
在这个视频中,我们将目前的基本技术以及主要缺陷和混杂因素,这可能会限制这个模型的预测值。
Protocol
为了保证高质量和可重复性,我们建议使用的标准操作程序(SOP)。在这个视频,发表在我们的实验室开发和使用的SOP应用1
1。大脑中动脉闭塞
- 小鼠与咨询兽医人员适当的麻醉制度麻醉。 (如诱导1.5 - 2%异氟醚和维护1.0 - 1.5%异氟醚2 / 3的N2O和1 / 3的氧气使用喷雾器)。
- 小鼠的体温保持在36.5 ° C ± 0.5 ° C在一个加热板手术。强烈建议,根据鼠标的直肠温度变暖的反馈控制的加热垫。
- 一个合适的代理(如70%酒精)消毒的皮肤和周围的皮毛和事后干燥。
- 中线颈部切口及软组织拉开。
- 左颈总动脉(LCCA)仔细解剖周围神经(不伤及迷走神经)和结扎是使用6.0/7.0字符串。也可用于5.0字符串。
- 然后分离左侧颈外动脉(莱萨)和第二个结。
- 接下来是孤立的,左侧颈内动脉(LICA)和6.0长丝准备了一个结。
- 左侧颈内动脉(LICA)和左侧翼腭动脉(LPA)获得良好的查看后,两动脉被裁剪,使用微血管剪辑。
- 之前,分叉的莱萨和LICA在LCCA切开一个小孔。然后引入一个单丝涂有硅固化剂混合物(见下文)的8.0尼龙LICA,直到它停在剪辑。要注意支付不进入枕动脉。 (图1)
- 剪切的动脉被打开,而灯丝插入到LICA闭塞Willis环的原产地的LMCA。
- 第三个结对LICA封闭,固定位置的灯丝。
- 小鼠接受生理盐水0.5毫升皮下注射量补货。缓解疼痛,利多卡因凝胶是在伤口局部应用。
- 如果再灌注的目的是,老鼠留30 - 90分钟在激烈的笼子闭塞,可以封闭伤口,用一个小的缝合片段。之后,进行第二次麻醉,结对ICA第三是瞬间打开灯丝撤回。
- 剩余的缝线缩短,适应与手术缝合皮肤。
- 所有的动物都收到如上所述,第二卷补货。
- 动物都放在了两个小时,体温控制在激烈的笼子。
- 动物必须每天检查,手术后不适的迹象。小鼠可能会表现出一定的手术减肥后。他们收到捣碎食物,在培养皿,培养皿放置在地板上,鼓励进食。七天每天食物取代。
2。假手术
- 深水作业的灯丝是插入到闭塞LMCA立即取消允许即时再灌注(1.8)。随后的操作是相同的,发生脑缺血(1.9 - 1.14)的动物,包括第二次麻醉。
3。灯丝的制备
- 应考虑灯丝不育。事后使用消毒设备,以及适当处理灯丝是无菌手术的先决条件。消毒的灯丝是困难的,因为许多常见的灭菌方法可能会恶化长丝的质量。然而,如辐射的方法,例如紫外线或γ射线,或化学灭菌,例如高活性气体,如环氧乙烷,都适用。
- 8.0锦纶长丝被切成长度为11毫米,在显微镜下
- 灯丝尖端必须超过8毫米的长度,完全并均匀地涂固化剂混合物的Xantopren中号黏膜和激活的NF Optosil
4。代表性的成果
血流量限制的期限,根据不同的电机和行为缺陷的结果。两个后30和脑缺血60分钟,在大多数情况下,动物抵抗力下降,横向推盘旋在运动障碍。温和的病变表现为一个在前面的李屈位置MBS。这些很容易观察到的迹象,可以用来作为手术成功的基本得分。
形态病变可使用或者组织学或磁共振成像(MRI)进行评估。六十分钟大脑中动脉闭塞,生产面积包括纹状体和大脑皮层组织pannecrosis,而30分钟,缺血引起主要限于纹状体的神经细胞死亡。梗死体积3(图2) ,我们预期标准偏差低于30%的一组操作。死亡率取决于阻断时间约5%后,30分钟缺血和10 - 60分钟后的20%。
另一种微创的可能性是使用激光多普勒血流计(LDF)的操作过程中,允许其成功的直接控制。在一个单个的动物,减少到10 - 20%preocclusion值明确表示局灶性脑缺血的成功归纳4然而,自卫队可以不被作为个体间的比较的方法使用,因为自卫队可以只测量定量的变化血(百分比)。流内的一个小而有限的组织样本量。它不给的血流量减少的空间范围的信息。
有几种测试,以评估中风后的行为方面,包括步态分析6,7,Rotarod 8,极测试9,10,不干胶去除测试11,12,13,14楼梯测试,梯级测试15,16和Morris水迷宫17。在所有这些测试中,受到缺血的小鼠比对照组动物执行较为成功。
图1。船只提供在小鼠大脑的架构(背景描绘)的计划。不同菌株可能会出现变化,例如的枕动脉,有时叶片颈内动脉。
图2。近端MCAO模型再灌注后不同时间点的典型病变大小的示意图。在中间,功能活动和脑血流量MCAO后的典型当然是描绘。 (MCAO:大脑中动脉闭塞,LDF激光多普勒血流测量)
Discussion
短暂的,18,19近端MCA闭塞模型,介绍了这里的模拟缺血性中风患者最常见的类型之一 。20变量灌注时间的基础上,该模型提供了不同档次的损害,从短暂性脑缺血发作( TIA)到大不等包括主要部件的缺血半球梗死。这使研究人员研究中风后不同的病理生理机制。 20,21
手术可以在很短的时间内,生产高度重复性病变。不过,这需要彻底控制了混杂因素。22在操作技术的细微差别可能占不同的效果梗死。23,24此外,由于脑血管解剖的差异,不同的小鼠品系表现出不同的结果 。 25,26机构温度影响,低温导致较小的病灶27和热疗,更严重的赤字的神经损伤 ,28因此,温度控制和维护在这个模型是高度相关的 。29此外,血压和血气结果的重要混杂因素和需要30,31快速,微创方法的使用(非侵入性血压测量,适合和容易访问的采血网站)进行监测。建议。麻醉剂的选择也是非常重要的,因为有些人可能有保护作用,和/或血管扩张剂,例如异氟醚 32因此,接触麻醉应尽可能和规范化。我们排除经历了手术时间超过15分钟的动物。
剃须手术部位产生microabrasions和炎症,并释放头发片段。这可能会进一步加重炎症和促进当地的感染,这可能会影响中风的病理生理。住房条件,特别是使用浓缩,可能会影响中风的结果,并应标准化,并在研究报告中描述的。6,33,34使用环境的丰富和重复性其效果是一个讨论的问题。35另一个重要混杂因素是中风引起的感染的风险,特别是经过较长时间的缺血36的,这会导致额外的发病率和死亡率增加。37,38感染症状在3至5天左右,这已长期在这种模型的后续行动的重要后果。
产生结果,为发展新的治疗中风,标准化和质量控制策略有关,是非常重要的翻译中风在临床前研究39“良好实验室规范 ”40,41任务。
- 使用动物的适当和详细的描述;
- 样本量的计算和报告预期的效果大小;
- 纳入和排除标准,之前设置的研究;
- 随机的分配到组;
- 分配隐蔽性调查;
- 报告从分析中排除的动物;
- 盲法评估的结果;
- 报告潜在的利益冲突和研究经费。
Disclosures
动物实验Landesamt附耳Gesundheit,柏林,德国和Soziales规定的准则和法规的规定执行。
Acknowledgments
这项工作是由欧洲共同体的第七框架计划(FP7/2007-2013)根据赠款协议N ° 201024和N ° 202213(欧洲中风网络)。 Bundesministerium献给教化和Forschung(柏林中风研究中心)和德意志研究联合会(Exzellenzcluster NEUROCURE)的额外资金。
作者想感谢Mareike Thielke(Dep.实验神经病学,柏林Charité)在操作过程中和埃尔克路德维希(Charité视频服务)制作动画的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical scissors (skin cut) | Fine Science Tools | 14028-10 | |
2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
Spring scissors (according to Vannas) | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Applying forceps for micro clamps | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro vascular clamp (e.g. S&G B1-V) | Fine Science Tools | 00396-01 | Also Serrefine possible |
2 Hemostats according to Hartmann | Fine Science Tools | 13002-10 | |
Needle holder (according Olsen-Hegar or other) | Fine Science Tools | 12002-14 | |
Standard anatomical forceps (for wound closure) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
5/0 sutures | Suprama | for vascular ligatures | |
6/0 sutures | Suprama | for skin suture, 5/0 also possible | |
Lidocaine (e.g. Xylocain Gel 2%) | AstraZeneca | or other local pain relief | |
Dissecting microscope (stereo microscope), magnification 6x to max. 40x | Leica Zeiss | MZ6 Stemi2000C | |
Cold light source | Leica Microsystems | KL1500 | |
Temperature feedback controlled heating pad system | Fine Science Tools | 21052-00 | With mouse pad and small probe |
Anaethesia system for isoflurane | |||
Isoflurane | Abott | ||
Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 | Heated cage |
8.0 nylon filament | Suprama | TEL181005 | for coating |
Scalpel | For cutting filament in pieces | ||
Ruler | To cut correct length of filament | ||
Xantopren M Mucosa | Heraeus Instruments | ||
Activator Universal Plus | Heraeus Instruments | Optosil - Xantopren | |
2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
A soft underlay for storing and grasping the uncoated filaments | e.g. swabs, foam, … | ||
Receptacle for new build filaments | e.g. petri dish, flexible foam,… |
References
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