Summary
Нитчатые окклюзии средней мозговой артерии общую модель для изучения ишемического инсульта у мышей.
Abstract
Инсульт является одной из наиболее частых причин смерти и инвалидности взрослого, особенно в высокоразвитых странах. Тем не менее, варианты лечения на данный момент весьма ограничены. Чтобы удовлетворить потребность в новых терапевтических подходов, экспериментальные исследования инсульта часто работают грызунов модели фокальной ишемии головного мозга. Большинство исследователей использовать постоянные или транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (СМА) у мышей и крыс.
Проксимальная окклюзия средней мозговой артерии (СМА) с помощью внутрипросветного техника наложения швов (так называемые лампы накаливания или шов модели), вероятно, наиболее часто используемые в экспериментальной модели инсульта исследований. Внутрипросветный модель MCAO имеет то преимущество, вызывающие воспроизводимых временной или постоянной ишемии территории MCA в относительно неинвазивным способом. Внутрипросветный подходы прерывание кровотока всей территории этой артерии. Накаливания окклюзии таким образом аресты поток проксимальнее lenticulo-полосатого артерий, которые снабжают базальных ганглиях. Накаливания окклюзии результаты MCA в воспроизводимых поражения в коре и полосатом теле и может быть постоянным или временным. В отличие от моделей вызывающие дистальных (для разветвления lenticulo-полосатого артерий) MCA окклюзия обычно запасных стриатуме и в первую очередь привлечь неокортекса. Кроме того, эти модели требуют удаление фрагментов костей черепа. В модели продемонстрировали в этой статье, кремния покрытая нить вводится в общей сонной артерии и передовые по внутренней сонной артерии в круг Уиллис, где она блокирует начало средней мозговой артерии. У пациентов, окклюзии средней мозговой артерии являются одними из наиболее частых причин ишемического инсульта. Так как различные ишемические интервалы могут свободно выбираться в этой модели в зависимости от момента времени реперфузии ишемического повреждения различной степени тяжести могут быть произведены. Реперфузии путем удаления окклюзии нити по крайней мере частично моделей восстановление кровотока после спонтанного или терапевтического (ТАП) лизис сгустка тромбоэмболических у людей.
В этом видео мы представим базовую технику, а также основных проблем и вмешивающиеся факторы, которые могут ограничить прогностическая ценность этой модели.
Protocol
Чтобы гарантировать высокое качество и воспроизводимость результатов, мы рекомендуем использовать стандартные операционные процедуры (СОП). В этом видео, опубликованное СОП, как разрабатываются и используются в нашей лаборатории применяются 1.
1. Окклюзии средней мозговой артерии
- Мыши наркозом с соответствующей анестезии режима в проконсультироваться с ветеринарным персоналом. (Например, индукция с 1,5 - 2% изофлюрана и обслуживания с 1,0 - 1,5% изофлюрана в 2 / 3 N2O и 1 / 3 O2 использования испарителя).
- Температура тела мышей поддерживается на уровне 36,5 ° C ± 0,5 ° C во время операции с нагревательного элемента. Обратная связь контролируемой грелку, которая нагревается в соответствии с ректальной температуры мыши, настоятельно рекомендуется.
- Лечить кожи и меха окружающих с помощью соответствующего средства (например, 70% этиловый спирт) и высушите его впоследствии.
- Средней линии шеи разрез сделан и мягких тканей тянутся друг от друга.
- Левой общей сонной артерии (LCCA) тщательно расчлененный свободным от окружающих нервов (без ущерба для блуждающего нерва) и лигатур осуществляется при помощи 6.0/7.0 строку. 5,0 строка может также использоваться.
- Левой внешней сонной артерии (Керамзит) затем отделяются и второй узел сделан.
- Затем левой внутренней сонной артерии (LICA) изолирована и узел подготовлен с 6,0 нити.
- Получив хороший вид на левой внутренней сонной артерии (LICA) и левой крылонебный артерии (МПУ), оба артерий, обрезаются с помощью микрососудистых клипа.
- Маленькое отверстие вырезается в LCCA перед его раздваивается, чтобы Керамзит и LICA. Мононити сделаны из нейлона 8,0 покрытием с кремнием отвердителя смесь (см. ниже), затем вводится в LICA, пока она не останавливается на клипе. Внимание должно быть уделено не вступать в затылочной артерии. (Рис. 1)
- Обрезанный артерии открываются в то время как нити вставляется в LICA окклюдировать происхождения LMCA в круг Уиллиса.
- Третий узел на LICA закрыта для исправления нити в нужном положении.
- Мышей получать солевой 0,5 мл подкожно, как объем пополнения. Для облегчения боли, Лидокаин гель местно применяемых в рану.
- Если реперфузии предназначен, мышей пребывания в течение 30 - 90 мин окклюзии в теплом клетки, рана может быть закрыто с небольшой клип шва. После этого второй анестезии выполняется, третий узел на ICA является мгновенная открыт и нити отозвано.
- Остальные швы сокращен и кожа адаптируется с хирургический шов.
- Все животные получают второе пополнение объема, как описано выше.
- Животных поместили в клетки нагревают в течение двух часов для контроля температуры тела.
- Животные должны проверяться ежедневно после операции по поводу признаков дискомфорта. Мышей может показать некоторые послеоперационные потери веса. Они получают пищу в пюре-Петри блюдо положили на пол, чтобы поощрять еды. Пища заменяется ежедневно в течение семи дней.
2. Шам операции
- Для операций, притворство нити вставляется закрывают LMCA и изъяты сразу, чтобы мгновенно реперфузии (1,8). Последующей эксплуатации идентична той, что производится на животных проходит церебральная ишемия (1,9 - 1,14), включая второй анестезии.
3. Подготовка накаливания
- Стерильность нити должны быть рассмотрены. Использование стерилизованного оборудования, а также надлежащего обращения с нитью впоследствии является необходимым условием для стерильных хирургии. Дезинфекция нити трудно, так как многие из распространенных методов стерилизации может ухудшить качество нити. Однако такие методы, как излучение, например, с УФ-светом или γ-лучей или химической стерилизации, например, с высокой реакционной способностью газов, таких как окись этилена, окись плату.
- 8,0 нейлоновые нити нарезают длиной 11 мм под микроскопом
- Нити наконечника должен быть покрыт полностью и равномерно по длине 8 мм с отвердителем смесь Xantopren М слизистой оболочки и Активатор NF Optosil
4. Представитель Результаты
В зависимости от продолжительности крови ограничение потока, различных двигателей и поведенческие результате дефицита. И после 30 и 60 мин ишемии головного мозга, животные в большинстве случаев показывают, снизилась устойчивость к боковой толчок и кружить в связи с нарушением в передвижении. Более мягкие поражения проявляются как сгибателей позиции в передней LiMBS. Эти легко наблюдаемые признаки могут быть использованы в качестве основных оценка для успеха операции 2.
Морфологически поражения можно оценить, используя либо гистологии или магнитно-резонансная томография (МРТ). Шестьдесят минут окклюзии средней мозговой артерии производит ткани pannecrosis в области в том числе и стриатуме и коре головного мозга, тогда как 30 минут ишемии причины главным образом нервных клеток смерти ограничивается полосатом теле. 3 (рис. 2) С точки зрения объема инфаркта, мы ожидаем, стандартное отклонение ниже, чем 30% в набор операций. Смертность зависит от окклюзии время около 5% после 30 мин ишемии и 10 - 20% через 60 мин.
Другой минимально инвазивные возможность использования лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ) в ходе операции, которая позволяет прямое управление ее успеха. В отдельных животных, снижение до 10 - 20% preocclusion значения четко указывает на успешное индукции фокальной ишемии головного мозга 4 Тем не менее, LDF не могут быть использованы в качестве метода для межличностных сравнений, так как LDF можно измерить только количественные изменения (в процентах) крови. потока в пределах небольшой и ограниченный объем образца ткани. Оно не дает информации о пространственной протяженности крови снижение потока 5.
Есть несколько тестов, чтобы оценить поведенческие аспекты, перенесших инсульт, в том числе анализа походки 6,7, Rotarod 8, поляк теста 9,10, клей тест удаление 11,12, подъезд тест 13,14, лестничные ступени теста 15,16 и Моррис водном лабиринте 17. Во всех этих тестов, мышей, подвергнутых воздействию MCAo выполнять менее успешно, чем у контрольных животных.
Рисунок 1. Схема архитектуры судна снабжения головного мозга (изображен на заднем плане) в мышь. Различные штаммы могут показать вариации, например затылочной артерии иногда выходит из внутренней сонной артерии.
Рисунок 2. Схематическое изображение типичных размеров поражения после того, различные моменты времени реперфузии в проксимальных модель MCAo. В середине, типичный ход функциональной активности и мозгового кровотока после MCAo изображены. (MCAo: средней мозговой артерии, LDF: Лазерные доплеровские измерения расхода)
Discussion
Модель переходных, проксимальная окклюзия СМА 18,19 представленные здесь имитирует один из наиболее распространенных видов ишемического инсульта у пациентов. 20 На основе переменной раза реперфузии, модель предлагает разные сорта ущерб от транзиторной ишемической атаки (ТИА) до крупных инфаркты в том числе основных частей ишемической полушарии. Это позволяет исследователю изучать различные патофизиологические механизмы после инсульта. 20,21
Операция может быть выполнена в короткий период времени и производит высокой воспроизводимостью поражений. Тем не менее, это требует тщательного контроля вмешивающихся факторов 22. Небольшие различия в работе техники может объясняться различными эффектами на инфаркт. 23,24 Кроме того, из-за различий в анатомии сосудов головного мозга, различных линий мышей показать другой результат. 25,26 тела Температура влияет на неврологическое повреждение, с переохлаждением, ведущие к меньшим поражением 27 и гипертермии к более серьезным дефицитом. 28 Соответственно, температурный контроль и техническое обслуживание является весьма актуальной в этой модели. 29 Кроме того, кровяное давление и газы крови являются важными вмешивающиеся факторы исхода и необходимость мониторинга. 30,31 использования быстрого и минимально инвазивных методов (неинвазивного измерения артериального давления, подходит и легко доступны сайты для сбора крови) рекомендуется. Выбор анестезии также очень важно, так как некоторые, возможно, нейропротекторное действие, и / или вазодилататоров, как, например изофлюрана 32. Следовательно, воздействие наркоза должна быть как можно короче и стандартизации. Мы исключаем животных, которые подверглись операции на срок более 15 мин.
Бритье места операции производит microabrasions и воспаление и освобождает волосы фрагментов. Это может еще более увеличить воспаления и стимулировать местные инфекции, которая может оказать влияние на ход патофизиологии. Жилищные условия, в особенности использование обогащения, может повлиять на ход и результаты должны быть стандартизированы и описаны в научных докладов. 6,33,34 использования экологических обогащения и его влияния на воспроизводимость является предметом обсуждения. 35 Другим важным является confounder индуцированный инсульт риск инфицирования, особенно после увеличения времени ишемии 36, что приводит к дополнительной заболеваемости и увеличению смертности. 37,38 Как стать симптоматической инфекции на отметке день от 3 до 5, это имеет важные последствия для долгосрочного наблюдения в таких моделей.
Для получения результатов, имеющих значение для разработки новых стратегий лечения инсульта, стандартизация и контроль качества очень важно в доклинических исследованиях поступательного инсульта 39 "надлежащей лабораторной практики" 40,41 мандатов.:
- надлежащие и подробное описание животных, используемых;
- Пример расчета размера и отчетности по размеру ожидаемого эффекта;
- критерии включения и исключения, созданный до начала исследования;
- рандомизации распределения по группам;
- скрытое отнесение в отношении следователей;
- отчетности животные исключены из анализа;
- ослеплены оценки результатов;
- сообщение о потенциальных конфликтах интересов и исследование финансирования.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Landesamt Fuer Gesundheit унд Soziales, Берлин, Германия.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась по Седьмой рамочной Европейское сообщество программа (FP7/2007-2013) в рамках грантового соглашения N ° 201024 и № 202213 (Европейская сеть Stroke). Дополнительное финансирование было дано Bundesministerium für Bildung унд Forschung (Центр исследований Stroke Берлин) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NEUROCURE).
Авторы хотели бы поблагодарить Марейке Thielke (отдел экспериментальной неврологии, Шарите Берлин) для поддержки во время операции и Эльке Людвиг (услуги Шарите видео) для создания анимации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical scissors (skin cut) | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Spring scissors (according to Vannas) | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Applying forceps for micro clamps | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Micro vascular clamp (e.g. S&G B1-V) | Fine Science Tools | 00396-01 | Also Serrefine possible |
| 2 Hemostats according to Hartmann | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Needle holder (according Olsen-Hegar or other) | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Standard anatomical forceps (for wound closure) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 5/0 sutures | Suprama | for vascular ligatures | |
| 6/0 sutures | Suprama | for skin suture, 5/0 also possible | |
| Lidocaine (e.g. Xylocain Gel 2%) | AstraZeneca | or other local pain relief | |
| Dissecting microscope (stereo microscope), magnification 6x to max. 40x | Leica Zeiss | MZ6 Stemi2000C | |
| Cold light source | Leica Microsystems | KL1500 | |
| Temperature feedback controlled heating pad system | Fine Science Tools | 21052-00 | With mouse pad and small probe |
| Anaethesia system for isoflurane | |||
| Isoflurane | Abott | ||
| Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 | Heated cage |
| 8.0 nylon filament | Suprama | TEL181005 | for coating |
| Scalpel | For cutting filament in pieces | ||
| Ruler | To cut correct length of filament | ||
| Xantopren M Mucosa | Heraeus Instruments | ||
| Activator Universal Plus | Heraeus Instruments | Optosil - Xantopren | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| A soft underlay for storing and grasping the uncoated filaments | e.g. swabs, foam, … | ||
| Receptacle for new build filaments | e.g. petri dish, flexible foam,… |
References
- Dirnagl, U. Members of the MCAO-SOP Group. Standard operating procedures (SOP) in experimental stroke research: SOP for middle cerebral artery occlusion in the mouse. Nature Precedings. , (2010).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
- Katchanov, J. Selective neuronal vulnerability following mild focal brain ischemia in the mouse. Brain Pathol. 13, 452-464 (2003).
- Dirnagl, U. Complexities, Confounders, and Challenges in Experimental Stroke Research: A checklist for researchers and reviewers in Rodent models of stroke. Dirnagl, U. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. 267-267 (2010).
- Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
- Wang, Y. A comprehensive analysis of gait impairment after experimental stroke and the therapeutic effect of environmental enrichment in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1936-1950 (2008).
- Lubjuhn, J. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184, 95-103 (2009).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20, 302-304 (1968).
- Matsuura, K., Kabuto, H., Makino, H., Ogawa, N. Pole test is a useful method for evaluating the mouse movement disorder caused by striatal dopamine depletion. J Neurosci Methods. 73, 45-48 (1997).
- Bouet, V. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203, 555-567 (2007).
- Freret, T. Delayed administration of deferoxamine reduces brain damage and promotes functional recovery after transient focal cerebral ischemia in the rat. Eur J Neurosci. 23, 1757-1765 (2006).
- Modo, M. Neurological sequelae and long-term behavioural assessment of rats with transient middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 104, 99-109 (2000).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 2-3 (1991).
- Baird, A. L., Meldrum, A., Dunnett, S. B. The staircase test of skilled reaching in mice. Brain Res Bull. 54, 243-250 (2001).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. J Neurosci Methods. 115, 169-179 (2002).
- Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. J Neurosci Methods. 153, 104-113 (2006).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11, 47-60 (1984).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Endres, M., Dirnagl, U. Neuroprotective Strategies in Animal and in vitro-Models of Neuronal Damage: Ischemia and Stroke. Molecular and Cellular Biology of Neuroprotection in the CNS. Alzheimer, C. , Kluver Academic and Landes Bioscience. New York. Vol. 513 455-474 (2003).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition). J Exp Stroke Transl Med. 2, 2-27 (2009).
- Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 174, 18-24 (2008).
- Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970, 1-2 (2003).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44, 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
- Florian, B. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438, 180-185 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349, 130-132 (2003).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35, 1720-1725 (2004).
- Shin, H. K. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39, 1548-1555 (2008).
- Bottiger, B. W. Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 65, 135-142 (1999).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
- Endres, M. Mechanisms of stroke protection by physical activity. Ann Neurol. 54, 582-590 (2003).
- Gertz, K. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99, 1132-1140 (2006).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Liesz, A. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia: immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40, 2849-2858 (2009).
- Meisel, C., Schwab, J. M., Prass, K., Meisel, A., Dirnagl, U. Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Nat Rev Neurosci. 6, 775-786 (2005).
- Engel, O., Meisel, A. Models of Infection Before and After Stroke: Investigating New Targets. Infect Disord Drug Targets. 9, (2010).
- Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1465-1478 (2006).
- Macleod, M. R. Good laboratory practice: preventing introduction of bias at the bench. Stroke. 40, 50-52 (2009).
- Group, S. T. A. I. R. Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development. Stroke. 30, 2752-2758 (1999).
