Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية سريعة لقياس إزفاء من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما من الخلايا التدفق الخلوي.
Abstract
الجلوكوز هو المصدر الرئيسي للطاقة في الجسم ، الأمر الذي يتطلب التنظيم المستمر لتركيز الدم والخمسين. الافراج عن الانسولين من البنكرياس يدفع امتصاص الغلوكوز من قبل الأنسجة الحساسة للأنسولين ، وعلى الأخص في الدماغ ، والعضلات والهيكل العظمي والخلايا الشحمية. المرضى الذين يعانون من مرض السكري نوع 2 و / أو السمنة غالبا ما تضع مقاومة الانسولين وغير قادرة على السيطرة على توازن الجلوكوز. وقد رؤى جديدة في آليات مقاومة الانسولين تقديم استراتيجيات جديدة لمعالجة مرض السكري من نوع 2.
الأسرة تخمة من ناقلات الجلوكوز يتكون من ثلاثة عشر عضوا موزعة على الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم 1. اكتب نقل الجلوكوز 4 (GLUT4) هو نقل الكبرى التي تتوسط امتصاص الأنسولين الجلوكوز الأنسجة الحساسة ، مثل العضلات والهيكل العظمي. عند الربط من الانسولين لمستقبله ، التي تحتوي على حويصلات GLUT4 نقل من مكان لآخر من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما ، وحمل امتصاص الغلوكوز. انخفاض GLUT4 إزفاء هي واحدة من أسباب مقاومة الانسولين في مرض السكري من نوع 2 2،3.
يمكن للإزفاء من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما التي يمكن تصور كيمياء سيتولوجية مناعية ، وذلك باستخدام fluorophore - مترافق GLUT4 محددة الأجسام المضادة.
هنا ، نحن تصف تقنية لتحديد مجموع المبالغ من GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما الخلايا خلال مدة المختار ، وذلك باستخدام التدفق الخلوي. هذا البروتوكول هو السريع (أقل من 4 ساعات ، بما في ذلك الحضانة مع الأنسولين) ويسمح تحليل بعض الخلايا مثل 3000 أو ما يصل إلى 1000000 في حالة الخلايا في تجربة واحدة. لأنه يعتمد على مكافحة GLUT4 الأجسام المضادة الموجهة إلى حاتمة الخارجية للنقل التي تربط إليها بأسرع ما يتعرض له المتوسط خارج الخلية بعد إزفاء إلى غشاء البلازما.
Protocol
1. خلية يلطخ
- تحضير الخلايا. وينبغي أن تستخدم الخلايا في حين لا يزال بنشاط متزايد (60-80 التقاء ٪). مصل تجويع الخلايا بين عشية وضحاها ، وخلايا لوحة لهم عند 0.1 مليون برميل في المتوسط 0،5 جيدا في المصل خالية مل في صفيحة ال 24 جيدا ووضعه في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة -- 2 ساعة لاسترداد من trypsinization.
- مزيج الأجسام المضادة الابتدائية والثانوية. مزيج (5 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة GLUT4 الأولية مع 1 ميكرولتر الضد الدجاج الثانوية مفتش مكافحة الماعز مترافق لAlexaFluor 488) x عدد الآبار. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام.
- إعداد المخزون 2X عمل الانسولين عن طريق تمييع في المتوسط.
- تحقق مما إذا الخلايا انضمت أم لا.
- إضافة بلطف 6 مزيج الأجسام المضادة ميكرولتر و0.5 مل من المخزون الخاص 2X عمل الانسولين في الآبار التي تحتوي على الخلايا. تجنب أي اضطراب في المتوسط. احتضان (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة ، في الظلام.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني PFA + 1 ٪ على كل جانب ، دون أن تهتز الخلايا. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام.
- إذا كان لديك الخلايا انضمت إلى الآبار ، ورفع بلطف لهم رافع الخلية. نقل الخلايا (1 مجموع مل) في الأنابيب التي تناسب في تدفق عداد الكريات الخاص وأجهزة الطرد المركزي لخلايا بيليه.
- تغسل مرتين مع بيليه في برنامج تلفزيوني مل 1 و resuspend في برنامج تلفزيوني 0.4 مل + 1 ٪ PFA. عند هذه النقطة ، يمكن أن تكون ملفوفة في احباط الخلايا وتخزينها في الثلاجة (4-8 درجة مئوية) ، أو نقله إلى تدفق عداد الكريات للحصول على البيانات الفورية.
2. الحصول على البيانات
- مجموعة بوابة واسعة حول الخلايا الحية في الجانب مبعثر (SSC) مقابل قدما مبعثر لوحة (FCS). استخدام أنبوب السلبية (خلايا لا تعامل مع الأنسولين أو الخلايا "ملطخة" مع عنصر تحكم isotype) لتعيين المعلمة FL1. تأكد الخاص بك هو ذروة تماما في لوحة ، وليس بقطع في الجانب السفلي.
- الحصول على البيانات من ما لا يقل عن 10000 الخلايا في الأنبوب.
3. تحليل البيانات
- رسم بوابة حول الخلايا الحية في لوحة SSC FSC مباراة (الشكل 1A). رسم رسوم بيانية للكثافة مضان مقابل 488 AlexaFluor عدد الخلايا الحية داخل بوابة خلايا (1B الشكل). يمكنك تراكب رسوم بيانية تصور مختلف لاختلاف الكميات ولكن ل، وتحديد كثافة وسيطة يعني مضان لكل خلية السكان واستخدام هذه الأرقام لإجراء مقارنات الخاص (الشكل 1C).
- تطبيع البيانات إلى القيمة التي تم الحصول عليها في غياب الأنسولين ، كما هو مبين في الأرقام و1C 1D.
4. ممثل النتائج
في myoblasts معزولة عن فرد صحية (أي مقاومة الانسولين) ، الانسولين يؤدي الى إزفاء تعتمد على الجرعة من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما (الشكل 1 ، يسار). في المقابل ، لا تحفز الانسولين GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما myoblasts عزلها من المريض مع مقاومة الانسولين (الشكل 1 ، يمين).
الشكل 1. مثال تجربة تلوين. وقد تم عزل Myoblasts من متبرع دون مقاومة الانسولين (يسار) ومن مريض مع مقاومة الانسولين (يمين) ألف ، SSC (مبعثر الجانب) مقابل FCS (مهاجم مبعثر) مؤامرة مع بوابة حول الخلايا الحية. باء ، في خلايا بوابات A ، ملطخة الأضداد ضد حاتمة GLUT4 الخارجية ، وترك unstimulated (الحمراء) أو حفز مع نانومتر 1 الانسولين (الأزرق) ، 10 نانومتر (البرتقال) ، أو 100 نيوتن متر (الخضراء). لوضوح الشكل ، وتبين لنا فقط البيانات دون و100 نانومتر مع الانسولين للخلايا مقاومة الانسولين. C ، متوسط كثافة مضان (MFI) من رسوم بيانية تظهر في وباء طبيعية لمؤسسات التمويل الأصغر من الخلايا unstimulated اليسار (لا الانسولين). D ، قطع من البيانات من مؤسسات التمويل الأصغر تطبيع رسوم بيانية تظهر في B.
Discussion
لقد أثبتنا تقنية سريعة لقياس إزفاء من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما من الخلايا التدفق الخلوي.
وأعرب هو عابر فقط GLUT4 في غشاء الخلايا والبلازما هي endocytosed. منذ أضداد ملزمة تظل مرتبطة GLUT4 ، حتى خلال الإلتقام ، ويعطي إشارة مضان المبلغ الإجمالي للGLUT4 التي تعرضت في غشاء البلازما خلال فترة الحضانة للاختيار في وجود الانسولين.
ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لدراسة إزفاء من البروتينات الأخرى من حجرة داخل الخلايا لغشاء البلازما ، وقدم جيدة الأضداد الموجهة إلى حاتمة الخارجية للبروتين من الفائدة المتاحة. على سبيل المثال ، يتم الآن فحص مشابهة تستخدم عادة لتقييم معدل تحبب الخلايا اللمفاوية التائية السامة القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية عن طريق قياس إزفاء من CD107a لغشاء البلازما من 4،5. يمكن أيضا أن إزفاء من فسفاتيديل من الجانب الداخلي للغشاء البلازما إلى الجانب الخارجي خلال موت الخلايا المبرمج أو نخر الخلية يمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي ، وذلك باستخدام fluorophore المسمى Annexin الخامس 6.
بالإضافة إلى سرعة في الفحص ، التدفق الخلوي يقدم ميزة تسمح للدراسة إزفاء البروتين إلى غشاء البلازما في الخلية المختلطة السكان. في الواقع ، يمكن للمرء أن يجمع بين تلطيخ لعلامات فرعية الخلايا والبروتين للاهتمام ، يليها الحصول على البيانات على تدفق عداد الكريات متعددة الليزر 7.
كميات من الأجسام المضادة الواردة في الفقرة 1.2 من البروتوكول هي نقطة الانطلاق ، ونحن نوصي معايرة الأضداد الخاص بخلايا اهتمامك لتحديد الحد الأدنى من تركيز الأجسام المضادة التي تمنحك إشارة الأقصى. ومن شأن مجموعة انطلاق جيدة لجسم الإنسان الأولية لمكافحة GLUT4 استخدمناها هنا سيكون ميكرولتر 10-10 في أنبوب (أي الأضداد ميكروغرام 0،2-2 في الأنبوب) ، كل أنبوب لا تحتوي على أكثر من 1 مليون خلية. عن الأجسام المضادة الأولية الأخرى ، يرجى الرجوع إلى تعليمات المورد.
تطبيع البيانات اللازمة كما تألق ذاتي للخلايا وسوف تختلف من مانح إلى آخر ومن تجربة إلى تجربة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من السيدة كليفورد غراهام الابيض إلدر هبوا صندوق البحوث والمعاهد الوطنية للصحة (AR059838) لبناء القدرات ، من المعاهد الوطنية للصحة (AR052791 ، AR044387 - الأذربيجانية ، وNS063298) لLTT ، وكلية بايلور للطب الخلوي والخلية الأساسية الفرز بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NCRR S10RR024574 ، NIAID AI036211 ، وP30CA125123 NCI). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر رسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Recombinant human insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Cell lifters | VWR international | 29942-118 | Cut to fit the wells |
| 5 ml tubes for FACS | VWR international | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
