Summary
이 프로토콜은 유동세포계측법에 의해 세포의 플라즈마 막으로 세포질에서 GLUT4의 translocation을 수치 빠른 방법을 설명합니다.
Abstract
포도당은 혈액 농도의 지속적인 규제를 요구, 신체 에너지의 주요 원천입니다. 췌장에서 인슐린 릴리스는 인슐린에 민감한 조직, 특히 뇌, 골격근, 그리고 adipocytes에 의해 포도당 이해를 유도. 타입 2 당뇨병 및 / 또는 비만의 고통 환자는 종종 인슐린 저항을 개발하고 그들의 포도당 항상성를 제어하는 수 없습니다. 인슐린 저항의 메커니즘에 새로운 통찰력은 유형 2 당뇨병에 대한 새로운 치료 전략을 제공할 수 있습니다.
포도당 전송기의 GLUT 가족은 신체 전반에 걸쳐 하나 다른 조직에 분산 열세 명의 회원으로 구성되어 있습니다. 포도당 수송 유형 4 (GLUT4)는 주요 전송기는 같은 골격근과 같은 인슐린에 민감한 조직에 의해 mediates 포도당 이해되는. 의 수용체에 인슐린의 결합되면, GLUT4는 포도당 이해를 유도, 플라즈마 막으로 세포질에서 이동시키다 포함 vesicles. 감소 GLUT4 translocation 형 - 2 당뇨병 2,3에서 인슐린 저항의 원인 중 하나입니다.
세포질에서 플라즈마 막에 GLUT4의 translocation이 형광단 - 복합 GLUT4 특정 항체를 사용, immunocytochemistry에 의해 시각하실 수 있습니다.
여기, 우리는 유동세포계측법를 사용하여 선택한 기간 동안 세포의 플라즈마 막에 GLUT4 translocation 총 금액을 수치 기법을 설명합니다. 이 프로토콜은 빠른 속도이다 (인슐린과 부화를 포함한 미만 4 시간)과 하나의 실험에서 3000 셀 또는 조건마다 많은 백만으로 세포 같이 몇 가지의 분석을 수 있습니다. 그것은 전송기의 외부 에피토프로 이동 방지 GLUT4 항체에 의존되는 즉시이 플라즈마 막에 translocation 후 세포 매체 노출로에 바인딩.
Protocol
1. 세포 스테 이닝
- 셀을 준비합니다. 아직 적극적으로 (- 80 % 코플루엔스 60) 성장하는 동안 세포를 사용해야합니다. 혈청은 인큐베이터에서 24 잘 플레이트와 장소에서 0.5 ML 혈청없는 중간에 하루 잘 당 0,100,000에 판 이들 세포를 세포를 굶어 (37 ° C, 5 % CO 2) 30 분 - 복구 ~ 2 시간 trypsinization에서.
- 기본 및 보조 항체를 섞는다. 믹스 (AlexaFluor 488에 복합 1 μL 보조 닭고기 방지 염소 IgG 항체와 기본 방지 GLUT4 항체의 5 μL) 웰스의 X 숫자. 어둠 속에서, 실온에서 10 분 알을 품다.
- 중간에 diluting에 의해 인슐린의 2X 작동 재고를 준비합니다.
- 세포가 준수하거나하지 않은 경우 확인하십시오.
- 부드럽게 세포를 포함하는 우물에 인슐린의 2X 작업 주식 6 μL 항체 믹스와 0.5 ML를 추가합니다. 매체의 난기류를 피하십시오. 알을 품다 (37 ° C 5 % CO 2) 30 분, 어둠 인치
- 세포를 떨지 않고, 각 잘하는 PBS + 1% PFA 0.5 ML를 추가하여 세포를 수정. 어둠 속에서, 실온에서 20 분 동안 품어.
- 당신의 세포가 우물을 준수있다면, 부드럽게 세포 리프터 그들을 리프트. 귀하의 흐름 cytometer에 맞게 및 펠릿 세포 원심 튜브에 세포를 (1 ML 합계) 전송.
- 0.4 ML PBS 1 ML PBS와 resuspend로 두 번 펠렛 + 1퍼센트 PFA 씻으십시오. 이 시점에서, 세포는 호일에 싸여 수 있으며 냉장고에 보관 (4-8 ° C) 또는 즉시 데이터 수집에 대한 흐름 cytometer로 이동합니다.
2. 데이터 수집
- 사이드 분산형 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FCS) 패널에서 살아있는 세포 주변 브로드 게이트를 설정합니다. 귀하의 FL1 매개 변수를 설정하는 부정적인 튜브 (세포가 인슐린이나 isotype 컨트롤과 함께 "스테인드"세포로 치료되지 않음) 사용합니다. 당신의 정상이 패널에서 완벽 하단 측면에 상처하지 않도록하십시오.
- 튜브 당 최소 10,000 세포에서 데이터를 수집.
3. 데이터 분석
- SSC VS FSC 패널 (그림 1A)에서 살아있는 세포 주위에 게이트를 그립니다. AlexaFluor 488 형광 강도를 비교 라이브 세포 게이트 내의 세포 (그림 1B)의 숫자의 histograms에 플롯. 당신은 차이를 시각화하기 위해 다른 histograms을 오버레이하지만 quantitation 위해 각 셀에 인구에 대한 의미와 평균 형광 강도를 결정하고 비교 (그림 1C) 이러한 숫자를 사용할 수 있습니다.
- 같은 인물 1C 및 1D에 표시된 인슐린의 부재에서 얻어진 값, 데이터를 정상화.
4. 대표 결과
건강한 개인 (NO 인슐린 저항)에서 고립 myoblasts에서 인슐린은 플라즈마 막 (그림 1, 왼쪽)으로 세포질에서 GLUT4의 복용 종속 translocation을 유도. 반대로, 인슐린은 인슐린 저항 (그림 1, 오른쪽)와 함께 환자의 격리 myoblasts의 플라즈마 막에 GLUT4 translocation을 유발하지 않습니다.
그림 1. 염색법 실험의 예. 에 Myoblasts가 인슐린 저항없이 기증자 (왼쪽)로부터 인슐린 저항 (오른쪽)와 함께 환자에서 고립되었다. 살아있는 세포 주위에 게이트가있는 A, SSC (사이드 분산형) 대 FCS (전진 분산형) 플롯. B, 세포는 게이 티드 A, GLUT4의 외부 에피토프에 대한 항체 물들일하고, unstimulated (적색) 또는 인슐린 1 NM (파란색), 10 NM (오렌지), 또는 100 nm의 (녹색)과 자극 떠났다. 그림의 지혜로움에 대해, 우리는 인슐린 저항과 전지 100 NM의 인슐린없이 데이터를 표시합니다. C는 B에 표시된 histograms의 형광 강도 (MFI) 세포의 MFI에 표준되었습니다 (NO 인슐린) unstimulated 왼쪽을 뜻합니다. D는 histograms에서 표준 MFI 데이터의 음모는 B.에 표시
Discussion
우리는 유동세포계측법에 의해 세포의 플라즈마 막으로 세포질에서 GLUT4의 translocation을 quantifying에 대한 신속한 기술을 증명하고있다.
GLUT4는 transiently 세포의 플라즈마 막에서 표현하고 endocytosed입니다. 바운드 항체도 endocytosis 동안 GLUT4에 연결된 상태 때문에, 형광 신호가 인슐린의 존재에 부화의 선택한 기간 동안 플라즈마 막에 노출되었다 GLUT4의 총 금액을 제공합니다.
이 기술은 또한, 플라즈마 막에 세포내 구획에서 다른 단백질의 translocation을 연구에 적용할 관심의 단백질의 외부 에피토프로 이동 좋은 항체 사용할 수 있습니다 제공될 수 있습니다. 예를 들어, 비슷한 분석은 이제 일반적으로 4,5 자신의 플라즈마 막에 CD107a의 translocation을 측정하여 세포 독성 T의 lymphocytes 자연 킬러 lymphocytes의 degranulation의 속도를 평가하는 데 사용됩니다. 세포 apoptosis 또는 괴사 동안 바깥쪽으로 플라즈마 막의 안쪽에서 phosphatidylserine의 translocation도 형광단 - 라벨 Annexin V 6을 사용, 유동세포계측법에 의해 감지하실 수 있습니다.
분석의 인텔리 게다가, 유동세포계측법 혼합 세포 집단에서 플라즈마 막에 단백질 translocation 연구를 허용 장점을 제공합니다. 사실, 하나는 세포 집합 표시 및 멀티 레이저 흐름 cytometer 7 데이터 수집 다음 관심의 단백질에 대한 얼룩을 결합할 수 있습니다.
프로토콜의 단락 1.2 주어진 항체의 금액은 출발점되며 우리는 당신이 당신에게 최대 신호를 제공하는 최소 항체 농도를 결정하기 위해 관심의 세포와 항체를 적정하다하는 것이 좋습니다. 우리가 사용한 주요 안티 - 인간 GLUT4 항체에 대한 좋은 시작 범위 튜브 당 1-10 μL (튜브 당 즉 0.2-2 μg 항체), 더 이상 백만 이상의 세포를 포함하는 각각의 튜브 것입니다. 다른 차 항체 들어, 공급 업체의 지침을 참조하십시오.
세포의 autofluorescence은 기증자로부터 기증하고 실험에서 실험을 다양하므로 데이터의 정상화가 필요합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 부인의 클리포드 엘더 화이트 그레이엄의 보조금에 의해 지원되었다 LTT하는 NIH (AR052791, AR044387 - 아라, & NS063298)에서, CB 연구 기금 & NIH (AR059838)를 둘러 싸인하고, 의학 Cytometry의 베일러 대학에서 NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, & NCI P30CA125123)에서 자금 코어 정렬과 셀. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Recombinant human insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Cell lifters | VWR international | 29942-118 | Cut to fit the wells |
| 5 ml tubes for FACS | VWR international | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
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