Summary
Ce protocole décrit une technique rapide pour quantifier la translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique des cellules par cytométrie en flux.
Abstract
Le glucose est la source principale d'énergie pour le corps, nécessitant une régulation constante de sa concentration sanguine. Libération d'insuline par le pancréas provoque l'absorption du glucose par l'insuline tissus sensibles, notamment le cerveau, les muscles squelettiques et les adipocytes. Les patients souffrant de diabète de type 2 et / ou l'obésité se développent souvent une résistance de l'insuline et sont incapables de contrôler leur homéostasie du glucose. Nouveaux éclairages sur les mécanismes de résistance à l'insuline peuvent fournir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le diabète de type 2.
La famille des transporteurs de glucose GLUT compose de treize membres répartis sur les différents tissus dans le corps 1. Type de transporteur du glucose 4 (GLUT4) est le transporteur de glucose majeurs qui médie l'absorption par les tissus sensibles à l'insuline, tels que le muscle squelettique. Lors de la liaison de l'insuline à son récepteur, la translocation des vésicules contenant GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique, provoquant la captation du glucose. Réduction GLUT4 translocation est l'une des causes de la résistance à l'insuline dans le diabète de type 2 2,3.
La translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique peut être visualisée par immunocytochimie en utilisant un fluorophore conjugué GLUT4 anticorps spécifiques.
Ici, nous décrivons une technique pour quantifier montant total de GLUT4 translocation vers la membrane plasmique des cellules pendant une durée choisie, en utilisant la cytométrie de flux. Ce protocole est rapide (moins de 4 heures, y compris d'incubation avec de l'insuline) et permet l'analyse d'aussi peu que 3000 cellules ou autant que 1 million de cellules par condition dans une expérience unique. Elle s'appuie sur l'anti-GLUT4 anticorps dirigé contre un épitope externes du transporteur qui se lient à elle dès qu'elle est exposée dans le milieu extracellulaire après la translocation vers la membrane plasmique.
Protocol
1. Coloration des cellules
- Préparer les cellules. Les cellules doivent être utilisées tout en pleine croissance (60 - 80% de confluence). Sérum affamer les cellules pendant la nuit, les cellules de la plaque à 0,1 million par puits dans 0,5 ml milieu sans sérum dans une plaque de 24 puits et les placer dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 30 min - 2 heures pour récupérer à partir trypsinisation.
- Mélanger les anticorps primaires et secondaires. Mélanger (5 pi de primaire anti-GLUT4 anticorps avec 1 poulet uL secondaire anti-chèvre anticorps IgG conjugué à AlexaFluor 488) x nombre de puits. Incuber 10 minutes à température ambiante, dans l'obscurité.
- Préparer un stock de travail de l'insuline 2X en le diluant dans le milieu.
- Vérifiez si les cellules ont adhéré ou non.
- Ajouter délicatement 6 mélange d'anticorps uL et 0,5 mL de votre stock de travail 2X de l'insuline dans les puits contenant les cellules. Évitez toute turbulence du milieu. Incuber (37 ° C, 5% CO 2) pendant 30 minutes, dans l'obscurité.
- Fixer les cellules en ajoutant 0,5 ml de PBS + 1% PFA dans chaque puits, sans secouer les cellules. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante, dans l'obscurité.
- Si vos cellules ont adhéré aux puits, délicatement les soulever avec un lifter cellule. Transférer les cellules (1 mL au total) dans des tubes qui correspondent à votre cytomètre en flux et centrifuger pour sédimenter les cellules.
- Laver le culot à deux reprises avec 1 ml de PBS et remettre en suspension dans 0,4 ml de PBS + 1% PFA. À ce stade, les cellules peuvent être enveloppés dans une feuille et de les conserver au réfrigérateur (4-8 ° C) ou prises pour le cytomètre en flux pour l'acquisition de données immédiates.
2. Acquisition de données
- Régler une porte large autour des cellules vivantes dans la diffusion latérale (SSC) par rapport à l'avant de dispersion (FCS) du panneau. Utiliser un tube négatif (cellules non traitées à l'insuline ou des cellules "taché" avec un contrôle isotypique) pour définir votre paramètre FL1. Assurez-vous de pointe est complètement dans le panneau, pas couper sur le côté inférieur.
- Acquérir des données provenant d'au moins 10 000 cellules par tube.
3. Analyse des données
- Dessinez une porte autour des cellules vivent dans le panneau CSS vs FSC (figure 1A). Tracer les histogrammes de 488 AlexaFluor intensité de fluorescence en fonction du nombre de cellules dans la porte des cellules vivantes (figure 1B). Vous pouvez superposer des histogrammes différents de visualiser les différences, mais pour la quantification, de déterminer l'intensité moyenne et la médiane de fluorescence pour chaque population de cellules et d'utiliser ces numéros pour vos comparaisons (figure 1C).
- Normaliser les données de la valeur obtenue en l'absence d'insuline, comme indiqué dans les figures 1C et 1D.
4. Les résultats représentatifs
Dans les myoblastes isolés d'un individu sain (pas de résistance à l'insuline), l'insuline induit une translocation dose-dépendante de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique (Figure 1, gauche). En revanche, l'insuline ne pas provoquer la translocation de GLUT4 à la membrane plasmique des myoblastes isolés à partir d'un patient avec résistance à l'insuline (Figure 1, droite).
Figure 1. Exemple d'une expérience de coloration. Myoblastes ont été isolés à partir d'un donneur sans résistance à l'insuline (à gauche) et chez un patient insulino-résistance (à droite). A, SSC (Side Scatter) versus FCS (forward scatter) parcelle avec une porte autour des cellules vivantes. B, les cellules fermées en Un, colorées avec l'anticorps contre un épitope externe de GLUT4, et de gauche non stimulées (rouge) ou stimulées par l'insuline 1 nm (bleu), 10 nm (orange), ou 100 nm (vert). Pour plus de clarté la figure, nous ne montrons données sans et avec 100 nM d'insuline pour les cellules insulino-résistance. C, les intensités moyennes de fluorescence (MFI) des histogrammes montré en B ont été normalisées à l'IMF des cellules non stimulées gauche (pas d'insuline). D, tracés des données normalisées de l'IMF histogrammes montré en B.
Discussion
Nous avons démontré une technique rapide pour quantifier la translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique des cellules par cytométrie en flux.
GLUT4 est seulement transitoirement exprimé à la membrane plasmique des cellules et est endocytose. Depuis les anticorps liés restent attachés à la GLUT4, même pendant l'endocytose, le signal de fluorescence donne le montant total de GLUT4 qui a été exposée à la membrane plasmique pendant la durée choisie d'incubation en présence d'insuline.
Cette technique peut également être appliquée à l'étude de la translocation d'autres protéines à partir d'un compartiment intracellulaire à la membrane plasmique, a fourni un bon anticorps dirigé contre un épitope externe de la protéine d'intérêt est disponible. Par exemple, un test similaire est maintenant couramment utilisé pour évaluer le taux de la dégranulation des lymphocytes T cytotoxiques et lymphocytes natural killer en mesurant la translocation de CD107a à leur membrane plasmique 4,5. La translocation de la phosphatidylsérine du côté intérieur de la membrane plasmique à la face externe lors de l'apoptose cellulaire ou une nécrose peut également être détectée par cytométrie en flux, en utilisant un fluorophore étiquetés annexine V 6.
Outre la rapidité de l'essai, la cytométrie en flux présente l'avantage de permettre l'étude de la translocation de la protéine à la membrane plasmique dans les populations de cellules mixtes. En effet, on peut combiner coloration pour les marqueurs de sous-ensemble de cellules et pour la protéine d'intérêt, suivie par l'acquisition de données sur un cytomètre en flux multi-laser 7.
Les quantités d'anticorps donnée au paragraphe 1.2 du protocole sont un point de départ; nous vous conseillons de titrer vos anticorps avec les cellules de votre intérêt pour déterminer la concentration d'anticorps minimum qui vous donne un maximum de signal. Une bonne gamme de départ pour le premier anticorps anti-humain GLUT4, nous avons utilisé ici serait uL 10-10 par tube (anticorps-dire 0,2 à 2 mg par tube), chaque tube contenant pas plus de 1 million de cellules. Pour les autres anticorps primaires, se reporter aux instructions du fournisseur.
La normalisation des données est nécessaire que l'autofluorescence des cellules varie d'un donneur à et d'une expérience à.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Mme Clifford Elder Graham White Doté Fonds de recherche et le NIH (AR059838) à CB, du NIH (AR052791, AR044387-ARRA, & NS063298) pour LTT, et par le Baylor College of Medicine de cytométrie et de tri cellulaire de base avec un financement du NIH (NCRR S10RR024574, le NIAID AI036211, & NCI P30CA125123). Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Recombinant human insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Cell lifters | VWR international | 29942-118 | Cut to fit the wells |
| 5 ml tubes for FACS | VWR international | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
