Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לכמת את טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום התא של תאים על ידי cytometry הזרימה.
Abstract
הגלוקוז הוא המקור העיקרי של אנרגיה לגוף, הדורשים ויסות מתמיד של הריכוז בדם שלה. שחרור אינסולין על ידי הלבלב גורם ספיגת הגלוקוז על ידי רקמות רגישות לאינסולין, בעיקר את המוח, שרירי השלד, וכן adipocytes. חולים שסובלים מסוכרת מסוג 2 ו / או השמנת יתר לעיתים קרובות לפתח עמידות לאינסולין אינם מסוגלים לשלוט הומאוסטזיס הגלוקוז שלהם. תובנות חדשות על מנגנוני עמידות לאינסולין עשויים לספק אסטרטגיות טיפול חדש לסוכרת מסוג 2.
משפחת שפע של מובילי הגלוקוז מורכב מחברי thirteen מופץ על רקמות שונות בגוף 1. טרנספורטר הגלוקוז סוג 4 (GLUT4) הוא טרנספורטר העיקריים מתווכת ספיגת הגלוקוז על ידי רקמות רגישות לאינסולין כמו שריר השלד. עם קשירה של אינסולין לקולטן שלו, שלפוחית המכילה GLUT4 translocate מן הציטופלסמה אל קרום התא, וגורם ספיגת הגלוקוז. צמצום GLUT4 טרנסלוקציה היא אחת הסיבות תנגודת לאינסולין סוג 2 סוכרת 2,3.
טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום התא ניתן דמיינו ידי immunocytochemistry, באמצעות fluorophore-מצומדות GLUT4 נוגדנים ספציפיים.
כאן אנו מתארים טכניקה לכמת סך של טרנסלוקציה GLUT4 קרום הפלזמה של תאים במהלך משך הנבחר, באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה הוא מהיר (פחות מ 4 שעות, כולל דגירה עם אינסולין) ומאפשר ניתוח של כמה כמו 3000 או תאים רבים ככל 1,000,000 תאים לכל תנאי בניסוי יחיד. היא מסתמכת על אנטי GLUT4 נוגדנים להפנות epitope חיצוני של המשלח אשר נקלטות על ידי אותה ברגע זה נחשף המדיום תאיים לאחר טרנסלוקציה על קרום התא.
Protocol
1. תא מכתים
- הכינו את התאים. התאים יש להשתמש תוך ומתרחב (60-80 מפגש%). סרום לילה להרעיב את התאים, התאים צלחת אותם 0,100,000 דולר היטב בינוני 0.5 מ"ל סרום ללא בצלחת 24-היטב ובמקום בחממה (37 ° C, 5% CO 2) דקות 30-2 שעות להתאושש מ trypsinization.
- מערבבים את נוגדנים ראשוניים ומשניים. מערבבים (5 μL של נוגדנים נגד GLUT4 ראשוני עם 1 נוגדן μL משני נגד עז עוף IgG מצומדות כדי AlexaFluor 488) x מספר בארות. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
- הכינו מלאי עבודה 2X של אינסולין על ידי דילול אותו בינוני.
- בדוק אם התאים יש דבק או לא.
- לערבב בעדינות להוסיף 6 נוגדן μL ו 0.5 מ"ל של המניה 2X שלך עובד של אינסולין כדי בארות המכיל את התאים. הימנע מכל מערבולת של המדיום. דגירה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 30 דקות, בחושך.
- תקן את התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של PBS PFA + 1% זה טוב, בלי לטלטל את התאים. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
- אם התאים שלך יש דבק הבארות, בעדינות להרים אותם עם מרים תא. העברת התאים (1 סה"כ מ"ל) לתוך הצינורות להשתלב cytometer תזרים שלך צנטריפוגות כדי גלולה התאים.
- שטפו את הכדור פעמיים עם 1 מ"ל PBS ו resuspend ב 0.4 מ"ל PBS + 1% PFA. בשלב זה, התאים יכולים להיות עטוף בנייר כסף ולאחסן במקרר (4-8 מעלות צלזיוס) או נלקח cytometer את זרימת לרכישת נתונים מיידית.
2. Data Acquisition
- קביעת שער רחב סביב תאים חיים לפזר את הצד (SSC) מול פאנל קדימה (FCS) פיזור. השתמש צינור שלילי (תאים לא שטופלו באינסולין או תאים "מוכתם" עם פקד אלוטיפ) כדי להגדיר פרמטר FL1 שלך. ודא השיא שלך לחלוטין בלוח, לא לחתוך בצד התחתון.
- רוכשת את נתוני לפחות 10,000 תאים לכל צינור.
3. ניתוח נתונים
- ציור השער סביב תאים חיים לעומת SSC FSC פאנל (איור 1A). מגרש היסטוגרמות של עוצמת הקרינה לעומת 488 AlexaFluor מספר התאים בתוך השער לחיות התא (איור 1B). ניתן כיסוי היסטוגרמות שונות כדי להמחיש הבדלים אבל quantitation, לקבוע את עוצמת הקרינה מתכוון החציוני של האוכלוסייה בכל תא להשתמש במספרים אלה להשוואות שלך (תרשים 1C).
- נרמל את הנתונים לערך המתקבל בהעדר אינסולין, כפי שמוצג 1C תרשימים 1D.
4. נציג תוצאות
ב myoblasts מבודד מאדם בריא (ללא תנגודת לאינסולין), אינסולין משרה טרנסלוקציה מינון תלויי של GLUT4 מן הציטופלסמה אל הממברנה פלזמה (איור 1, משמאל). לעומת זאת, האינסולין אינו לגרום GLUT4 טרנסלוקציה על קרום התא של myoblasts מבודד חולה עם עמידות לאינסולין (איור 1, מימין).
באיור 1. דוגמה של ניסוי מכתים. Myoblasts בודדו מתורם ללא תנגודת לאינסולין (משמאל) מחולה עם עמידות לאינסולין (מימין). A, SSC (פיזור בצד) לעומת FCS (קדימה פיזור) העלילה עם שער סביב תאים חיים. B, תאים סגורה ב , מוכתם נוגדנים נגד epitope חיצוני של GLUT4, והשאיר unstimulated (אדום) או מגורה עם 1 ננומטר אינסולין (כחול), 10 ננומטר (כתום), או 100 ננומטר (ירוק). למען הבהירות דמות, אנחנו רק להציג נתונים בלי ועם אינסולין 100 ננומטר עבור התאים עם עמידות לאינסולין. C, ממוצע עוצמות הקרינה (MFI) של היסטוגרמות שמוצג B היו מנורמל ל MFI של תאים שמאל unstimulated (לא אינסולין). D, מגרשים של הנתונים מנורמל MFI מ היסטוגרמות המוצג ב
Discussion
אנחנו הוכיחו טכניקה מהירה לכימות טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום הפלזמה של תאים על ידי cytometry הזרימה.
GLUT4 מתבטאת רק transiently על קרום התא של תאים הוא endocytosed. מאז נוגדנים מחויב להישאר צמודים GLUT4, אפילו במהלך אנדוציטוזה, האות הקרינה נותן את הסכום הכולל של GLUT4 כי נחשף הקרום פלזמה במהלך תקופת הדגירה של נבחר בנוכחות של אינסולין.
טכניקה זו יכולה לחול גם על לימוד טרנסלוקציה של חלבונים אחרים בתא תאיים על ממברנת פלזמה, ובלבד נוגדן טוב להפנות epitope חיצוני של החלבון עניין זמין. לדוגמה, assay דומה כיום נפוץ כדי להעריך את שיעור degranulation ציטוטוקסיות של לימפוציטים מסוג T ו לימפוציטים הרוצח טבעי על ידי מדידת טרנסלוקציה של CD107a אל הממברנה הפלסמטית 4,5 שלהם. טרנסלוקציה של phosphatidylserine מהצד הפנימי של קרום התא אל הצד החיצוני במהלך האפופטוזיס התא או נמק יכול גם להתגלות על ידי cytometry זרימה, באמצעות fluorophore שכותרתו Annexin V 6.
מלבד המהירות של assay, cytometry זרימה מציג את היתרון המאפשר לימוד של טרנסלוקציה חלבון קרום התא פלזמה באוכלוסיות מעורבות. אכן, אפשר לשלב מכתים עבור סמנים משנה התא לחלבון של עניין, ואחריו רכישת נתונים על cytometer רב לייזר זרימה 7.
כמויות של נוגדנים שניתן בסעיף 1.2 של פרוטוקול הם נקודת התחלה: אנו ממליצים לכיל הנוגדנים שלך עם תאים העניין שלך כדי לקבוע את ריכוז הנוגדן המינימום שנותן לך אות מקסימלית. מגוון התחלה טובה הנוגדן אנטי אנושי ראשוני GLUT4 השתמשנו כאן יהיה μL 1-10 לכל שפופרת (כלומר 0.2-2 נוגדן מיקרוגרם לכל צינור), כל צינור המכיל לא יותר מ 1 מיליון תאים. עבור נוגדנים ראשוניים אחרים, עיין בהוראות של הספק.
נורמליזציה של הנתונים כנדרש autofluorescence של תאים ישתנו מתורם לתורם ו מניסוי לניסוי.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קליפורד הגברת זקן לבן גרהם נתרמו לקרן מחקר ה-NIH (AR059838) ל CB, מ-NIH (AR052791, AR044387-ערה, & NS063298) כדי LTT, ועל ידי במכללת ביילור לרפואה cytometry ו-Cell מיון Core במימון ה-NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, P30CA125123 & NCI). התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Recombinant human insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Cell lifters | VWR international | 29942-118 | Cut to fit the wells |
| 5 ml tubes for FACS | VWR international | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
