Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए एक तेजी से प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं के cytoplasm से प्लाज्मा झिल्ली GLUT4 के स्थानान्तरण यों तकनीक का वर्णन करता है.
Abstract
ग्लूकोज शरीर के लिए ऊर्जा का मुख्य स्रोत है, अपने रक्त एकाग्रता की निरंतर विनियमन की आवश्यकता है. अग्न्याशय द्वारा इंसुलिन रिलीज इंसुलिन के प्रति संवेदनशील ऊतकों, सबसे विशेष रूप से मस्तिष्क, कंकाल की मांसपेशी, और adipocytes द्वारा ग्लूकोज तेज लाती है. टाइप 2 मधुमेह और / या मोटापे से पीड़ित रोगियों को अक्सर इंसुलिन प्रतिरोध के विकास और उनके ग्लूकोज homeostasis नियंत्रण करने में असमर्थ हैं. इंसुलिन प्रतिरोध के तंत्र में नई अंतर्दृष्टि टाइप -2 मधुमेह के लिए नए उपचार रणनीति प्रदान कर सकता है.
ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों की भरमार परिवार 1 पूरे शरीर में तेरह विभिन्न ऊतकों पर वितरित सदस्यों के होते हैं. ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर प्रकार 4 (GLUT4) प्रमुख ट्रांसपोर्टर है कि mediates इंसुलिन कंकाल की मांसपेशी जैसे संवेदनशील ऊतकों द्वारा ग्लूकोज तेज. इंसुलिन की अपनी रिसेप्टर के लिए बाध्य करने पर GLUT4 प्लाज्मा झिल्ली cytoplasm से सरकाना, ग्लूकोज तेज उत्प्रेरण युक्त vesicles. कम GLUT4 स्थानान्तरण टाइप 2 मधुमेह 2,3 में इंसुलिन प्रतिरोध के कारणों में से एक है .
GLUT4 के cytoplasm से प्लाज्मा झिल्ली स्थानान्तरण immunocytochemistry द्वारा visualized किया जा fluorophore संयुग्मित GLUT4 विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर सकते हैं.
यहाँ, हम एक चुना अवधि के दौरान कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली GLUT4 स्थानान्तरण की कुल मात्रा यों तकनीक का वर्णन है, प्रवाह cytometry का उपयोग. यह प्रोटोकॉल तेजी है (इंसुलिन के साथ ऊष्मायन सहित कम से कम 4 घंटे,) और के रूप में एक ही प्रयोग में 3,000 या कक्षों प्रति शर्त के रूप में कई के रूप में 1 लाख कोशिकाओं के रूप में कुछ के विश्लेषण की अनुमति देता है. यह विरोधी GLUT4 ट्रांसपोर्टर के एक बाहरी मिलान करने के लिए निर्देशित एंटीबॉडी पर निर्भर करता है है कि यह करने के लिए के रूप में जल्द ही के रूप में यह प्लाज्मा झिल्ली के लिए स्थानान्तरण के बाद कोशिकी माध्यम से अवगत कराया है बाँध.
Protocol
1. सेल धुंधला
- कोशिकाओं को तैयार है. कोशिकाओं, जबकि अभी भी सक्रिय रूप से बढ़ (- 80% संगम 60) किया जाना चाहिए. सीरम कोशिकाओं भूखा रातोंरात, 24 अच्छी तरह से एक थाली और इनक्यूबेटर में जगह में 0.5 एमएल सीरम मुक्त माध्यम में उन्हें अच्छी तरह से प्रति 0.1 मिलियन पर थाली कोशिकाओं (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 30 मिनट के लिए - 2 घंटे ठीक करने के लिए trypsinization से.
- प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी मिक्स. (1 μL माध्यमिक विरोधी बकरी चिकन आईजीजी AlexaFluor 488 के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ 5 प्राथमिक एंटीबॉडी विरोधी GLUT4 μL) कुओं की संख्या x मिक्स. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में, सेते हैं.
- यह मध्यम में गिराए द्वारा इंसुलिन की एक 2X काम कर रहे स्टॉक तैयार है.
- जाँच करें अगर कोशिकाओं पालन किया है या नहीं.
- धीरे कोशिकाओं से युक्त कुओं करने के लिए 6 μL एंटीबॉडी और अपने इंसुलिन के 2X काम स्टॉक के 0.5 एमएल मिश्रण जोड़ें. माध्यम के किसी भी अशांति से बचें. सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 30 मिनट के लिए, अंधेरे में.
- प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं मिलाते हुए बिना पीबीएस + 1% पीएफए के 0.5 एमएल, उनका कहना है द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए अंधेरे में, सेते हैं.
- यदि आपके कोशिकाओं कुओं का पालन किया है, धीरे उन्हें एक सेल चोर के साथ उठा. कोशिकाओं (1 एमएल कुल) ट्यूब है कि अपने प्रवाह cytometer में फिट और गोली कोशिकाओं के लिए अपकेंद्रित्र में स्थानांतरण.
- 1 एमएल पीबीएस और resuspend के साथ दो बार + 0.4 एमएल पीबीएस में 1% पीएफए गोली धो लें. इस बिंदु पर, कक्षों पन्नी में लपेटा जा सकता है और फ्रिज में संग्रहीत (4-8 डिग्री सेल्सियस) या तत्काल डाटा अधिग्रहण के लिए प्रवाह cytometer के लिए ले लिया.
2. डाटा अधिग्रहण
- ओर तितर बितर (एसएससी) बनाम आगे तितर बितर पैनल (FCS) में जीवित कोशिकाओं के चारों ओर एक व्यापक गेट सेट. एक नकारात्मक ट्यूब (कोशिकाओं को इंसुलिन या "दाग" एक निर्धारण नियंत्रण के साथ कोशिकाओं के साथ इलाज नहीं है) का उपयोग करने के लिए अपने FL1 पैरामीटर सेट. यकीन है कि अपने चरम पैनल में पूरी तरह से है, कम पक्ष पर कटौती नहीं.
- ट्यूब प्रति कम से कम 10,000 कक्षों से डेटा मोल.
3. डेटा विश्लेषण
- एसएससी बनाम FSC पैनल (चित्रा 1 ए) में जीवित कोशिकाओं के चारों ओर एक फाटक ड्रा. AlexaFluor 488 प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम रहते सेल फाटक के भीतर कोशिकाओं (चित्रा 1B) की संख्या के histograms प्लॉट. आप अलग histograms उपरिशायी मतभेद कल्पना लेकिन quantitation के लिए, प्रत्येक सेल की आबादी के लिए मतलब है और मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण और अपने तुलना (चित्रा 1C) के लिए इन नंबरों का उपयोग कर सकते हैं.
- इंसुलिन के अभाव में प्राप्त मान है, के रूप में आंकड़े 1C और 1D में दिखाया गया डेटा सामान्यकरें.
4. प्रतिनिधि परिणाम
एक स्वस्थ व्यक्ति (कोई इंसुलिन प्रतिरोध) से अलग myoblasts में, इंसुलिन प्लाज्मा झिल्ली (चित्रा 1, बाएं) के cytoplasm से GLUT4 की एक खुराक पर निर्भर स्थानान्तरण लाती है. इसके विपरीत, इंसुलिन इंसुलिन प्रतिरोध (चित्रा 1, सही) के साथ एक रोगी से अलग myoblasts के प्लाज्मा झिल्ली GLUT4 स्थानान्तरण प्रेरित नहीं करता है.
चित्रा 1 एक धुंधला प्रयोग के उदाहरण. Myoblasts इंसुलिन प्रतिरोध के बिना एक दाता (बाएं) और इंसुलिन प्रतिरोध (दाएं) के साथ एक मरीज से पृथक किया गया, (पक्ष स्कैटर) एसएससी बनाम FCS जीवित कोशिकाओं के चारों ओर एक फाटक के साथ साजिश (आगे स्कैटर ) बी. कक्ष में gated एक GLUT4 की एक बाहरी मिलान के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग, और (लाल) unstimulated या इंसुलिन एक एनएम (नीला), 10 एनएम (नारंगी), या 100 एनएम (हरा) के साथ प्रेरित छोड़ दिया. आंकड़ा स्पष्टता के लिए, हम केवल बिना और इंसुलिन प्रतिरोध के साथ कोशिकाओं के लिए 100 एनएम इंसुलिन के साथ डेटा दिखाने के लिए सी, histograms के प्रतिदीप्ति (एमएफआई) तीव्रता बी में दिखाया गया छोड़ दिया कोशिकाओं के एमएफआई के लिए सामान्यीकृत unstimulated (कोई इंसुलिन) मतलब.. विकास, histograms से सामान्यीकृत एमएफआई के डेटा का भूखंड बी में दिखाया गया है
Discussion
हम प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं के cytoplasm से प्लाज्मा झिल्ली GLUT4 के स्थानान्तरण बढ़ाता के लिए एक तेजी से तकनीक का प्रदर्शन किया है.
GLUT4 केवल transiently कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त की है और endocytosed. चूंकि बाध्य एंटीबॉडी GLUT4 के लिए endocytosis के दौरान भी संलग्न रहते हैं, प्रतिदीप्ति संकेत GLUT4 की कुल राशि है कि प्लाज्मा झिल्ली में इंसुलिन की उपस्थिति में ऊष्मायन के चुने हुए अवधि के दौरान उजागर किया गया था देता है.
इस तकनीक को भी प्लाज्मा झिल्ली के लिए एक intracellular डिब्बे से अन्य प्रोटीन के स्थानान्तरण का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता सकता है, एक अच्छा ब्याज की प्रोटीन का एक बाहरी मिलान करने के लिए निर्देशित एंटीबॉडी प्रदान उपलब्ध है. उदाहरण के लिए, एक समान परख अब सामान्यतः करने के लिए अपने प्लाज्मा 4,5 झिल्ली CD107a के स्थानान्तरण को मापने के द्वारा साइटोटोक्सिक टी lymphocytes और प्राकृतिक हत्यारा लिम्फोसाइटों के degranulation की दर का आकलन किया . सेल apoptosis या परिगलन के दौरान बाहर की ओर के लिए प्लाज्मा झिल्ली के भीतर की ओर से phosphatidylserine के स्थानान्तरण भी प्रवाह cytometry द्वारा पता लगाया जा सकता है, fluorophore - लेबल Annexin वी 6 का उपयोग कर.
परख की तेज़ी के अलावा, प्रवाह cytometry मिश्रित सेल आबादी में प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन करने के लिए स्थानान्तरण के अध्ययन की अनुमति का लाभ प्रस्तुत करता है. वास्तव में, एक सेल सबसेट मार्करों के लिए और ब्याज की प्रोटीन, एक प्रवाह बहु लेजर 7 cytometer पर डाटा अधिग्रहण के द्वारा पीछा के लिए धुंधला हो जाना गठबंधन कर सकते हैं.
एंटीबॉडी की मात्रा प्रोटोकॉल के पैरा 1.2 में दिए गए एक प्रारंभिक बिंदु हैं, हम अनुशंसा करते हैं कि आप ब्याज की अपनी कोशिकाओं के साथ अपने एंटीबॉडी टाइट्रेट न्यूनतम एंटीबॉडी एकाग्रता है कि आप अधिकतम संकेत देता है निर्धारित है. प्राथमिक विरोधी मानव GLUT4 एंटीबॉडी हम यहां इस्तेमाल किया है के लिए एक अच्छा प्रारंभिक रेंज ट्यूब प्रति 1-10 μL (यानी प्रति 0.2-2 ट्यूब μg एंटीबॉडी), हर कोई अधिक से अधिक 1 मिलियन कोशिकाओं से युक्त ट्यूब होगा. अन्य प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के संदर्भ लें.
डेटा के सामान्यीकरण के लिए आवश्यक है के रूप में कक्षों की autofluorescence दाता दाता से करने के लिए और प्रयोग से प्रयोग करने के लिए अलग अलग होंगे.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम श्रीमती क्लिफर्ड बड़ी व्हाइट ग्राहम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था सीबी रिसर्च फंड और NIH (AR059838) संपन्न, एनआईएच (AR052791, AR044387 ARRA, NS063298) से LTT, और चिकित्सा Cytometry के Baylor कॉलेज द्वारा और NIH (NCRR S10RR024574, AI036211 NIAID और P30CA125123 NCI) से धन के साथ कोर छंटनी सेल. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और करता एनआईएच की आधिकारिक दृश्य जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Recombinant human insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Cell lifters | VWR international | 29942-118 | Cut to fit the wells |
| 5 ml tubes for FACS | VWR international | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
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