Summary
Detta protokoll beskriver en snabb teknik för att kvantifiera på flyttning av GLUT4 från cytoplasman till plasmamembranet av celler med flödescytometri.
Abstract
Glukos är den främsta källan till energi för kroppen, kräver ständig reglering av dess blodkoncentration. Insulinfrisättning i bukspottkörteln inducerar glukos upptag av insulin-känsliga vävnader, främst hjärnan, skelettmuskel och adipocyter. Patienter som lider av typ-2 diabetes och / eller övervikt ofta utveckla insulinresistens och inte kan kontrollera sina glukoshomeostas. Nya insikter om mekanismerna bakom insulinresistens kan ge nya behandlingsstrategier för typ 2-diabetes.
Den GLUT familj glukos transportörer består av tretton medlemmar fördelat på olika vävnader i hela kroppen 1. Glukos transportör typ 4 (GLUT4) är den största transportören som förmedlar glukosupptag av insulin känsliga vävnader såsom skelettmuskulatur. När insulin binds till sin receptor, blåsor innehåller GLUT4 translocate från cytoplasman till plasmamembranet, förmå glukosupptag. Minskad GLUT4 translokation är en av orsakerna till insulinresistens i typ-2 diabetes 2,3.
Flyttning av GLUT4 från cytoplasman till plasmamembranet kan visualiseras genom immuncytokemi, med hjälp av fluoroforen-konjugerad GLUT4-specifika antikroppar.
Här beskriver vi en teknik för att kvantifiera det totala belopp av GLUT4 translokation till plasmamembranet av celler under en vald tid, med hjälp av flödescytometri. Detta protokoll är snabb (mindre än 4 timmar, inklusive inkubation med insulin) och kan analys av så få som 3000 celler eller så många som 1 miljon celler per tillstånd i ett enda experiment. Den bygger på anti-GLUT4 antikroppar riktade till en extern epitop av transportören som binder till den så snart som det är utsatt till den extracellulära mediet efter translokation till plasmamembranet.
Protocol
1. Cellfärgning
- Förbered cellerna. Cellerna bör användas samtidigt aktiv tillväxt (60 - 80% sammanflödet). Serum svälta cellerna natten, tallrik dem cellerna till 0,1 miljoner per väl i 0,5 ml serumfritt medium i ett 24-brunnar och plats i inkubatorn (37 ° C, 5% CO 2) i 30 min - 2 timmar för att återhämta sig från trypsinization.
- Blanda de primära och sekundära antikroppar. Blanda (5 mikroliter av den primära anti-GLUT4 antikropp med en mikroliter sekundär kyckling anti-get IgG-antikropp konjugerad med AlexaFluor 488) x antal brunnar. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Förbered en 2X arbetar bestånd av insulin genom att späda den i medium.
- Kontrollera om cellerna har anslutit sig eller inte.
- Tillsätt försiktigt 6 mikroliter antikropp mix och 0,5 ml av din 2X fungerar lager av insulin till brunnarna som innehåller celler. Undvik all turbulens i mediet. Inkubera (37 ° C, 5% CO 2) i 30 minuter i mörker.
- Fixera cellerna genom att tillsätta 0,5 mL PBS + 1% PFA i varje brunn, utan att skaka cellerna. Inkubera 20 minuter vid rumstemperatur, i mörkret.
- Om dina celler har anslutit sig till brunnar, försiktigt lyfta dem med en cell lyftare. Överför celler (1 ml totalt) i rör som passar i din flödescytometern och centrifugera till pellets cellerna.
- Tvätta pelleten två gånger med 1 mL PBS och återsuspendera i 0,4 ml PBS + 1% PFA. Vid denna punkt kan celler slås in i folie och förvaras i kylskåp (4-8 ° C) eller tas till flödescytometern för omedelbar datainsamling.
2. Data Acquisition
- Ställ en bred grind runt levande celler i sidospridning (SSC) jämfört med Forward Scatter (FCS) panel. Använd en negativ rör (celler som inte behandlas med insulin eller celler "målat" med en isotypisk kontroll) att ställa in FL1 parameter. Se till att din topp är helt i panelen, inte minska på den nedre sidan.
- Få uppgifter från minst 10.000 celler per rör.
3. Data Analysis
- Rita en grind runt levande celler i SSC mot FSC-panel (Figur 1A). Rita histogram för AlexaFluor 488 fluorescensintensitet kontra antal celler i levande celler grind (Figur 1B). Du kan lägga olika histogram för att visualisera skillnader men för kvantifiering, bestämma medelvärdet och medianen fluorescensintensiteten för varje cell befolkningen och använda dessa nummer för din jämförelser (Figur 1C).
- Normalisera data till det värde som erhålls i frånvaro av insulin, vilket visas i figur 1C och 1D.
4. Representativa resultat
I myoblasts isolerad från en frisk person (ingen insulinresistens), inducerar insulin en dosberoende flyttning av GLUT4 från cytoplasman till plasmamembranet (Figur 1, vänster). Däremot inducerar insulin inte GLUT4 translokation att membranet på myoblasts isolerade från en patient med insulinresistens (figur 1, höger).
Figur 1. Exempel på en färgning experiment. Myoblasts var isolerade från en donator utan insulinresistens (vänster) och från en patient med insulinresistens (höger). A, SSC (Side Scatter) jämfört med FCS (Forward Scatter) tomt med en grind runt levande celler. B, Celler gated i A, färgade med antikroppen mot en yttre epitop av GLUT4, och lämnade ostimulerade (röd) eller stimuleras med insulin 1 nm (blå), 10 Nm (orange), eller 100 nM (grön). För figur tydlighet visar vi bara data utan och med 100 nM insulin för att cellerna med insulinresistens. C, Mean fluorescens intensiteter (MFI) i histogrammen som visas i B normaliserades till MFI i cellerna vänster ostimulerade (inget insulin). D, tomter av normaliserade MFI data från histogram som visas i B.
Discussion
Vi har visat en snabb teknik för att kvantifiera på flyttning av GLUT4 från cytoplasman till plasmamembranet av celler med flödescytometri.
GLUT4 är bara tillfälligt uttryckt i membranet på celler och är endocyteras. Eftersom de bundna antikropparna finns kvar på den GLUT4, även under endocytos, ger fluorescenssignalen den totala GLUT4 som var utsatt till plasmamembranet under den valda varaktigheten av inkubation i närvaro av insulin.
Denna teknik kan också användas för att studera på flyttning av andra proteiner från en intracellulär facket till plasmamembranet, gav en bra antikropp riktad mot en extern epitop av proteinet av intresse är tillgänglig. Till exempel är en liknande assay nu allmänt används för att bedöma graden av degranulering av cytotoxiska T-lymfocyter och naturliga lymfocyter mördare genom att mäta på flyttning av CD107a deras plasma membrane 4,5. Flyttning av fosfatidylserin från insidan av plasmamembranet till den yttre sidan under apoptos eller nekros kan också upptäckas med flödescytometri, med hjälp av fluoroforen-märkt Annexin V 6.
Förutom snabbheten i analysen presenterar flödescytometri den fördelen att studiet av protein translokation till plasmamembranet i blandade cellpopulationer. I själva verket kan man kombinera färgning för markörer cell delmängden och för proteinet av intresse, följt av datainsamling på en multi-laser flödescytometer 7.
De belopp av antikroppar som anges i punkt 1.2 i protokollet är en utgångspunkt, vi rekommenderar att du titrera dina antikroppar med dina celler av intresse att bestämma den lägsta koncentrationen av antikroppar som ger dig en maximal signal. En bra start sortiment för den primära anti-human GLUT4 antikropp har vi använt här skulle vara 10-10 mikroliter per rör (dvs 0,2-2 mikrogram antikropp per rör), varje rör som inte innehåller mer än 1 miljon celler. För andra primära antikroppar, se leverantörens anvisningar.
Normalisering av data är nödvändig som autofluorescens av celler kommer att variera från givare till givare och från experiment till experiment.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från Mrs Clifford Elder Vit Graham Begåvad Research Fund och NIH (AR059838) till CB, från NIH (AR052791, AR044387-Arra, & NS063298) till LTT och av Baylor College of Medicine Cytometry och Cell Sortering Core med finansiering från NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, & NCI P30CA125123). Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Recombinant human insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Cell lifters | VWR international | 29942-118 | Cut to fit the wells |
| 5 ml tubes for FACS | VWR international | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
