Summary
Bu protokol, flow sitometri ile hücre plazma membranı, sitoplazma GLUT4 translokasyon ölçmek hızlı bir teknik anlatılmaktadır.
Abstract
Glikoz kan konsantrasyonunun sabit düzenleme gerektiren, vücut için temel enerji kaynağıdır. Pankreas tarafından insülin salınımını, insüline duyarlı dokularda, özellikle beyin, iskelet kası ve adipositler glikoz alımını tetikler. Tip-2 diyabet ve / veya obezite muzdarip hastalar genellikle insülin direnci geliştirme ve kendi glikoz dengesini kontrol edemiyoruz. Insülin direnci mekanizmaları getirdiği yeni anlayışlar, tip-2 şeker hastalığı için yeni tedavi stratejileri sağlayabilir.
1 vücut boyunca farklı dokular üzerinde dağıtılan onüç üyelerinin, glikoz nakliyecilerin GLUT aile oluşur . Glukoz transporter tipi 4 (GLUT4) önemli bir taşıyıcı gibi iskelet kası gibi hassas dokular, insülin aracılık glukoz alımı. Insülin reseptörüne bağlanması üzerine, GLUT4 glukoz alımı inducing plazma membranı, sitoplazma yerini değiştirmek içeren vezikül. Azaltılmış GLUT4 translokasyon, insülin direnci, tip-2 diyabet 2,3 nedenlerinden biridir.
Sitoplazmaya plazma membran GLUT4 translokasyon fluorofor-konjuge GLUT4 özel antikorları kullanarak, immünsitokimya tarafından görüntülenmiştir.
Burada, flow sitometri kullanılarak, seçilen bir süre boyunca hücrelerinin plazma membranı translokasyonu GLUT4 toplam miktarını ölçmek için bir teknik açıklar. Bu protokol hızlı (daha az insülin ile inkübasyon dahil olmak üzere 4 saat) ve tek bir deney 3000 hücreleri veya durum ortalama 1 milyon hücreleri gibi birkaç analiz sağlar. En kısa sürede plazma membranı translokasyonu sonra ekstrasellüler ortama maruz bağlamak taşıyıcı bir dış epitop yönelik anti-GLUT4 antikorlar dayanmaktadır.
Protocol
1. Hücre Boyama
- Hücreleri hazırlayın. Hücreler hala aktif olarak büyürken (-% 80 izdiham 60) kullanılmalıdır. Serum inkübatörde 24-plaka ve yerine 0.5 ml serum orta, bir gecede ortalama 0,1 milyon plaka onları hücreler hücreleri açlıktan (37 ° C,% 5 CO 2) 30 dakika - 2 saat kurtarmak için trypsinization gelen.
- Birincil ve ikincil antikorlar karıştırın. Mix (1 AlexaFluor 488 konjuge mcL ikincil tavuk anti-keçi IgG ile anti-GLUT4 birincil antikor 5 mcL) x kuyu sayısı. Karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- Orta sulandırmaya insülin 2X çalışma stok hazırlayın.
- Hücrelerin yapıştırılacağı ya da varsa kontrol edin.
- Hücreleri içeren kuyu insülin 2X çalışma stoku 6 mcL antikor karışımı ve 0.5 mL yavaşça ekleyin. Orta herhangi bir türbülans kaçının. Inkübe (37 ° C,% 5 CO 2) 30 dakika süreyle karanlıkta.
- Hücrelerin sallayarak olmadan, her bir kuyunun 0.5 mL PBS +% 1 PFA ekleyerek hücrelerin sabitleyin. Karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
- Hücreleri kuyulardan yapıştırılır varsa, yavaşça bir hücre kaldırıcı bunları kaldırın. Akış sitometresinin uyum ve pelet hücreler santrifüj tüpleri hücreleri (toplam 1 ml) aktarın.
- 0,4 ml PBS ile iki kez 1 ml PBS ile tekrar süspansiyon pelet +% 1 PFA yıkayın. Bu noktada, hücrelerin folyoya sarılı ve buzdolabında saklanabilir (4-8 ° C) ya da hemen veri toplama için akış sitometresi götürüldü.
2. Veri Toplama
- Yan dağılım (SSC) karşı forward scatter (FCS) paneli canlı hücrelerin etrafındaki geniş bir kapı ayarlayın. FL1 parametre ayarlamak için olumsuz bir tüp (hücrelerin insülin veya bir izotipi kumanda ile "lekeli" hücre ile tedavi) kullanın. Zirve, panel tamamen alt tarafında kesilmiş değil emin olun.
- Tüp başına en az 10.000 hücre veri almak.
3. Veri Analizi
- SSC vs FSC paneli (Şekil 1A) canlı hücrelerin etrafındaki bir kapı çizin. AlexaFluor 488 floresan yoğunluğu karşısında, canlı hücre kapısı içinde hücre (Şekil 1B) sayısı histogramlar çizilir. Farklılıkları görselleştirmek için farklı histogramlar kaplaması, ancak kantitatif için, her bir hücre popülasyonu için ortalama ve medyan floresan belirlemek ve karşılaştırmalar (Şekil 1C) için bu numaraları kullanabilirsiniz.
- Şekil 1C ve 1D gösterildiği gibi insülin yokluğunda elde edilen değer, veri Normale.
4. Temsilcisi Sonuçlar
, Sağlıklı bir birey (insülin direnci) izole matür olarak, insülin, plazma zarı (Şekil 1, sol) sitoplazma GLUT4 doza bağımlı bir translokasyon neden olur. Buna karşın, insülin, insülin direnci (Şekil 1, sağ) ile bir hastadan izole matür plazma membranı translokasyonu GLUT4 neden değildir.
Şekil 1 boyama deney örneği. Matür insülin direnci olmayan bir donör (sol) ve insülin direnci (sağda) ile bir hastadan izole edildi. Canlı hücrelerin etrafındaki bir kapı ile SSC (yan dağılım) karşı FCS (forward scatter) arsa B, Hücreler kapılı GLUT4 harici bir epitop karşı antikor ile boyandı ve unstimulated (kırmızı) veya insülin 1 nM (mavi), 10 nM (turuncu), ya da 100 Nm (yeşil) ile uyarılan bıraktı. Rakam netliği için, biz sadece 100 nM insülin hücrelerin insülin direncine sahip olmadan ve verileri göstermektedir. C, B gösterilen histogramlar floresan yoğunlukları (MFI) (insülin) hücrelerin MFI normalize edildi unstimulated sol ortalama. D, histogramlar normalize MFI veri Arsalar B.
Discussion
Biz flow sitometri ile hücre plazma membranı sitoplazma GLUT4 translokasyon miktarının belirlenmesi için hızlı bir teknik ortaya koymuştur.
GLUT4, sadece geçici olarak hücre plazma membranı ifade edilir ve endocytosed. Bağlı antikorlar endositoz sırasında bile, GLUT4 bağlı kaldığından, floresan sinyal insülin varlığında inkübasyon seçilen süresince plazma zarı maruz GLUT4 toplam tutarı verir.
Bu teknik aynı zamanda, plazma zarı, hücre içi bölümünden diğer proteinlerin translokasyon eğitimi için uygulanan ilgi protein harici bir epitop yönelik iyi bir antikor mevcut olabilir. Örneğin, benzer bir analiz şimdi yaygın 4,5, plazma zarı CD107a translokasyon ölçerek sitotoksik T lenfositler ve doğal öldürücü lenfositleri degranülasyonunun oranını değerlendirmek için kullanılır. Plazma zarının iç tarafında hücre apoptozis veya nekroz sırasında dış tarafına fosfatidilserin translokasyon fluorofor etiketli Annexin V 6 kullanarak, flow sitometri ile tespit edilebilir.
Flow sitometri, testin hızla yanı sıra, protein, karışık hücre popülasyonlarının plazma membranı translokasyonu çalışma izin avantajı sunuyor. Gerçekten de, bir hücre alt belirteçleri için bir çok lazer akış sitometresinin 7 veri toplama takip ilgi protein, boyama ve birleştirebilirsiniz.
Protokol paragraf 1.2 'de verilen antikorların miktarda bir başlangıç noktası; ilgi hücreleri antikorlar titre minimum antikor konsantrasyonunu belirlemek için bir maksimum sinyal verir. Burada kullanılan birincil anti-insan GLUT4 antikor için iyi bir başlangıç aralığı 1-10 mcL tüp başına (yani tüp başına 0,2-2 mg antikor), en fazla 1 milyon daha içeren hücreler her tüp olacaktır. Diğer primer antikorlar için, tedarikçinin talimatlarına bakın.
Hücre otofloresans donörden donör ve deney deney yapmak değişecektir olarak veri normalleşmesi gerekmektedir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Bayan Clifford Yaşlı Beyaz Graham hibeleri tarafından desteklenen LTT NIH (AR052791, AR044387-arra & NS063298), CB Araştırma Fonu ve Ulusal Sağlık Enstitüsü, (AR059838) donatılmış ve Baylor College of Medicine Sitometri NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, NCI P30CA125123) finansmanı ile Çekirdek Ayırma ve Hücre. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Recombinant human insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Cell lifters | VWR international | 29942-118 | Cut to fit the wells |
| 5 ml tubes for FACS | VWR international | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
