Summary
Es wird allgemein verstanden, dass mechanische Kräfte in den Körper kann die Zelldifferenzierung und Zellteilung beeinflussen. Hier präsentieren wir ein Video-Protokoll, das die Verwendung eines speziell angefertigten Bioreaktor für die Bereitstellung von einachsigen zyklischen Zugbelastung auf Zellen auf flexible Substrate mikrostrukturierten kultivierten Stammzellen.
Abstract
Die Rolle der mechanischen Kräfte in der Entwicklung und Pflege von biologischen Geweben ist gut dokumentiert, darunter mehrere mechanisch reguliert Phänomene wie Knochenumbau, Muskelhypertrophie und glatten Muskelzellen Plastizität. Allerdings sind die beteiligten Kräfte oft sehr komplex und schwer zu überwachen und zu steuern in vivo. Um besser zu untersuchen, die Auswirkungen der mechanischen Kräfte auf Zellen, haben wir ein in vitro Verfahren zum Aufbringen von einachsigen zyklischen Zugbelastung auf adhärente Zellen auf elastischen Membranen kultivierten entwickelt. Diese Methode verwendet einen speziell entworfenen Bioreaktor mit einem motorisierten cam-Rotor-System, um die gewünschte Kraft aufbringen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Video-Protokoll zeigt, wie die verschiedenen Komponenten eines jeden "stretch Kammer", auch in diesem Fall, eine Silikon-Membran mit mikrostrukturierten Topographie zu orientieren die Zellen mit der Richtung des Stammes zu versammeln. Wir beschreiben auch Verfahren zur Entkeimung von den Kammern, säen die Zellen auf der Membran, Verriegelung der Kammer in den Bioreaktor und die Anpassung der mechanischen Parameter (zB Größe und Geschwindigkeit der Belastung). Die Verfahren in diesem speziellen Protokoll dargelegt sind spezifisch für die Aussaat von humanen mesenchymalen Stammzellen auf Silikon-Membranen mit 10 pm breiten Kanälen parallel zur Richtung der Dehnung. Doch die Methoden und Materialien in diesem System vorgestellt flexibel genug, um eine Reihe von Variationen zu diesem Thema aufnehmen, sind: Dehnrate, Größe, Dauer, Zelltyp, Membran-Topographie, Membran-Beschichtung, etc. können alle auf die gewünschte Anwendung oder zugeschnitten werden Ergebnis. Dies ist eine robuste Methode zur Untersuchung der Auswirkungen von einachsigen Zugbelastung aufgebracht, um Zellen in vitro.
Protocol
Tag 0 - Sterilisation vor dem Tag des Experiments
- Legen Sie Material in Kunststoff-Wanne und sterilisieren mit 70% Alkohol für 2 Stunden:
- Chambers
- Deckel
- Frames (alle 3 Teile)
- Schrauben
- Gummidichtungen
- Zange
- Schere
- Hex-Schlüssel
- Saubere Membranen mit Aquet Seife und destilliertem Wasser.
- Mit Ultraschall-Membranen in 70% igem Alkohol für 10 Minuten.
- Legen Sie die sauberen Membranen in Kunststoff-Quadrat Gerichte. Bei Verwendung von gemusterten Membranen, sicherzustellen, dass die strukturierte Seite ist offen (Spray Alkohol auf der einen Seite der Membran und achten Sie auf die Flüssigkeit zu heruntergekommen die Rillen).
- Lassen Membranen in 70% igem Alkohol für 2 Stunden abgedeckt.
- Package Handschuhe in Alufolie zum Autoklavieren morgen früh.
- Machen Sie 2% (Gewicht / Volumen) Gelatine-Lösung (2g/100mL) in destilliertem Wasser zum Autoklavieren morgen.
- Nach dem 2 Stunden Sterilisation in 70% Alkohol, statt alle Polymer-Materialien und Membranen (non-autoklavierbar Materialien) in die Haube über Nacht UV:
- Chambers
- Deckel
- Frames (alle 3 Teile)
- Membranen
- Pack restlichen Materialien in autoklavierbar Tasche:
- Schrauben
- Gummidichtungen
- Zange
- Schere
- Hex-Schlüssel
Tag 1 - Montage von Stretch-Kammern
- Autoclave Zangen, Scheren, Inbusschlüssel, Schrauben, Dichtungen, Handschuhe und Gelatine mit kleinen Autoklaven bei 240 ° F für 20 Minuten insgesamt
- Entfernen Membranen aus UV und behandeln mit O 2-Plasma (gemusterten Seite nach oben) für ~ 1 Minute.
- In TC Haube, Deckel gemusterte Bereich der Plasma behandelten Membranen mit Gelatine. Coat 30 für Minuten unter UV-Licht.
- Waschen Sie jede Membran mit PBS 2X. Nach dem 2. waschen, verlassen einige PBS auf den Membranen zu halten rutschig, zur leichteren Montage in die Kammern. (Sollte auch dieses PBS, um die Dichtungen für einfachere Montage schmieren).
- Montieren Membranen in Kammern (Verschleiß autoklaviert Handschuhe während der Montage)
- Verbinden Sie die beiden wichtigsten Stücke des Rahmens mit einer einzigen Schraube.
- Klappen Sie den Rahmen um und legen eine Membran auf der Oberseite, so dass die Gelatine beschichtete Seite zugewandt dem Rahmen (der gemusterten Fläche sollte in der Mitte sein).
- Befestigen Sie die Membran mit dem Rahmen mittels einer Dichtung auf jeder Seite.
- Drücken Sie die Dichtungen in, mit sanftem, gleichmäßigem Druck, damit sie nicht reißen die Membran.
- Bringen Sie montierten Rahmen, um T-bar.
- Klappen Sie den Rahmen und Ort in die Kammer auf den Kopf. UV Rückseite des Rahmens und die Membran für 30 Minuten
- Klappen Sie den Rahmen wieder, und schrauben in Kammern (keine Änderung für die Steuerung Kammer, sondern auch für Stretch-Kammer, müssen zwei Schrauben zu verwenden, um das Endstück des Rahmens auf den Boden der Kammer legen und müssen die einzelne Schraube, die sich entfernen Halten die beiden Stücke des Rahmens zusammen). UV Vorderseite für 30 min. Sicherstellen, dass die Membranen sind völlig trocken sein, bevor Sie mit dem nächsten Schritt, oder aber die Zell-Lösung abrutschen kann bei der Aussaat.
- Seed-Zellen. Fläche von 1 Platte = Fläche von 3 Membranen, so verwenden 1 / 3 einer konfluenten Platte pro Membran. Verwenden Sie 1 ml Lösung pro Zelle Membran. Nicht mehr als 1,5 ml wird schwierig sein, Lösung zu halten auf. Setzen Sie Zelle Lösung nur auf gemusterten Fläche, und verwenden Sie die Pipettenspitze auf die Lösung zu verstreuen. Abdeckung Kammern und lassen Zellen für 30 Minuten RT in der Motorhaube befestigen.
- Bewegen Kammern Inkubator und lassen Zellen für 1 Stunde anzuhängen. Seien Sie SEHR vorsichtig bewegt die Kammern zu verhindern, dass Zell-Lösung abrutschen! Die Zellen in dieser Kammer wird ruiniert, wenn die Lösung fällt an dieser Stelle.
- Zurück Kammer Kapuze und fügen 20 mL Medien.
- Legen Kammern in Alkohol gereinigt Wanne, die mit Alufolie (auch mit Alkohol besprüht) abgedeckt ist. Bewegen Kammern Inkubator (10% CO 2) zu dehnen.
- Sichere Kammern in Stretch-Maschine. Lassen Zellen über Nacht weiter befestigen, und starten Strecke auf den nächsten Tag. (Anmerkung: beim Anlegen Kammern in Stretchmaschine, denken Sie daran, die Maschine in die "Null" Position zu verriegeln, bevor Kammern, und ziehen Sie dann das Gummiband um die Gänge Vergessen Sie nicht, die Gänge vor dem Start der Maschine zu entsperren.).
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Discussion
Banes et al. erstmals über die Verwendung eines Systems für die mechanische Stimulation der Zellen in vitro durch eine flexible elastomere Substrat mechanische Kraft auf die Zellen 1 liefern. Seit dieser Zeit haben viele Variationen dieses Design konzipiert und genutzt werden. Verschiedene mechanische Dehnung Systeme sind kommerziell unter dem Namen "Flexercell" (Flexcell International Corp) verfügbar, während einige Labore custom-built-Geräte verwenden. In diesem Video-Protokoll haben wir die Einrichtung und Nutzung eines solchen Gerätes in unserem Labor beschrieben.
Die custom-built "Stretch-Maschine" in diesem Protokoll dargestellt hat in verschiedenen Studien eingesetzt, um die Auswirkungen der einachsigen zyklischen Belastung auf verschiedene Zelltypen 2,3 untersuchen. Diese Maschine ist ein vielseitiges Gerät mit mehreren einstellbaren Parameter, die für eine Vielzahl von mechanischen Belastungen Studien verwendet werden können. Das Setup-Seite abgebildet sind, stellt eine einzigartige und robuste Methode für die Bereitstellung von einachsigen zyklischen Belastungen auf adhärente Zellen in Kultur.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
