Summary
הוא הבין נרחב כי כוחות מכניים בגוף יכול להשפיע על התמיינות תאים ושגשוגם. כאן אנו מציגים פרוטוקול וידאו הממחיש את השימוש bioreactor שהותקן עבור אספקת המתח uniaxial מתיחה מחזורית לתאי גזע בתרבית על מצעים גמישים micropatterned.
Abstract
תפקידה של כוחות מכניים בפיתוח ותחזוקה של רקמות ביולוגיות מתועדת היטב, כולל תופעות מוסדר מכנית כמה כגון שיפוץ העצם, היפרטרופיה שרירים, גמישות חלקה תא שריר. עם זאת, הכוחות המעורבים הם בדרך כלל מורכבת מאוד וקשה לפקח ולשלוט in vivo. כדי לחקור טוב יותר את ההשפעות של כוחות מכניים על תאים, פיתחנו שיטה חוץ גופית ליישום זן uniaxial מתיחה מחזורית תאים בתרבית חסיד על ממברנות אלסטיות. שיטה זו משתמשת bioreactor אישית מעוצבת עם מערכת ממונע פקה-הרוטור ליישם את הכוח הרצוי. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד וידאו המדגים כיצד להרכיב את הרכיבים השונים של "תא למתוח" כל אחד, כולל, במקרה זה, קרום סיליקון עם הטופוגרפיה micropatterned כדי לכוון את התאים לכיוון של המתח. אנחנו גם לתאר נהלים לחיטוי לתאי, זריעת תאים על הממברנה, ונועלת את החדר לתוך bioreactor, ואת התאמת פרמטרים מכניים (כלומר, גודל וקצב זן). ההליכים המפורטים בפרוטוקול המסוים הזה הם ספציפיים עבור זריעת אדם בתאי גזע mesenchymal על ממברנות סיליקון עם 10 ערוצי רחב מיקרומטר בכיוון מקביל לכיוון של מתח. עם זאת, שיטות וחומרים המוצג במערכת זו הינם גמישים מספיק כדי להכיל מספר וריאציות על נושא זה: שיעור זן, גודל, משך, סוג התא, הטופוגרפיה קרום, ציפוי קרום, וכו 'יכולים להיות מותאם ליישום הרצוי או התוצאה. זוהי שיטה חזקים בודק את ההשפעה של מתח מתיחה uniaxial להחיל תאים במבחנה.
Protocol
0 יום - עיקור לפני יום של הניסוי
- מכניסים חומרים לאמבטיה פלסטיק לחטא באלכוהול 70% למשך 2 שעות:
- צ'יימברס
- מכסים
- מסגרות (כל 3 יח')
- ברגים
- גומי אטמים
- מצבטים
- מספרים
- Hex ברגים
- ממברנות נקי עם Aquet סבון ומים מזוקקים.
- Sonicate ממברנות באלכוהול 70% למשך 10 דקות.
- מניחים את הקרומים נקי לתוך צלחות פלסטיק מרובע. אם באמצעות ממברנות בדוגמת, להבטיח שהצד בדוגמת היא עם הפנים כלפי מעלה (אלכוהול לרסס על צד אחד של הממברנה ולראות את הנוזל לרוץ במורד חריצים).
- השאירו ממברנות מכוסה אלכוהול 70% למשך 2 שעות.
- חבילת כפפות לתוך רדיד אלומיניום עבור מעוקר מחר בבוקר.
- בצע 2% (משקל / נפח) פתרון ג'לטין (2g/100mL) במים מזוקקים עבור מעוקר מחר.
- לאחר עיקור 2 שעה באלכוהול 70%, במקום כל חומרים פולימריים ממברנות (לא autoclavable חומרים) לתוך מכסה המנוע עבור UV לילה:
- צ'יימברס
- מכסים
- מסגרות (כל 3 יח')
- ממברנות
- חבילת החומרים הנותרים לתוך שקית autoclavable:
- ברגים
- גומי אטמים
- מצבטים
- מספרים
- Hex ברגים
יום 1 - האסיפה בתאי למתוח
- החיטוי מלקחיים, מספריים, ברגים hex, ברגים, אטמים, כפפות ג'לטין באמצעות החיטוי קטן 240 מעלות במשך 20 דקות בסך הכל
- הסר ממברנות מ UV ולטפל עם O 2 פלסמה (צד בדוגמת למעלה) למשך דקה 1 ~.
- בשכונה TC, לכסות שטח בדוגמת של ממברנות פלזמה שטופלו ג'לטין. מעיל 30 דקות תחת UV.
- לשטוף כל קרום עם PBS 2X. לאחר לשטוף את 2, להשאיר כמה PBS על הממברנות כדי לשמור אותם חלקלק, קל להרכבה לתוך התאים. (כדאי גם להשתמש PBS כדי לשמן את אטמי להרכבה קלה יותר).
- להרכיב ממברנות לתאי (ללבוש כפפות autoclaved בזמן ההרכבה)
- חבר את שני החלקים העיקריים של המסגרת בעזרת בורג יחיד.
- תהפכו את המסגרת מעל המקום קרום על גבי כל כך את הג'לטין מצופה צד כלפי פנים מסגרת (אזור בדוגמת צריך להיות במרכז).
- אבטח את הממברנה למסגרת באמצעות אטם בצד אחד.
- לחצו על אטמים ב, תוך שימוש עדין, ואפילו לחץ, כדי לא לקרוע את הקרום.
- צרף מסגרת התאספו T-בר.
- תהפכו את המסגרת ואת המקום לתוך תא במהופך. הצד האחורי של מסגרת UV קרום במשך 30 דקות
- תהפכו את המסגרת שוב, בורג לתאי (ללא שינוי חדר בקרה, אבל תא למתוח, צריך להשתמש שני ברגים כדי לחבר את הקטע בסוף של המסגרת אל החלק התחתון של החדר, ואת הצורך להסיר את בורג יחיד מחזיק את שני החלקים של המסגרת יחד). חזית צד UV למשך 30 דקות. ודא ממברנות הן להתייבש לחלוטין לפני שממשיכים לשלב הבא, אחרת את הפתרון הסלולרי עלול להחליק במהלך זריעה.
- זרעים תאים. שטח אזור 1 = צלחת של 3 ממברנות, ולכן השימוש 1 / 3 צלחת ומחוברות לכל הממברנה. השתמש ב 1 מ"ל של פתרון לכל קרום התא. כל 1.5mL יותר יהיה קשה לשמור על פתרון. שים פתרון התא רק על אזור בדוגמת, ולהשתמש קצה פיפטה להפיץ את פתרון סביב. מכסים לתאי ולתת תאים לצרף במשך 30 דקות RT בשכונה.
- העבר לתאי אל חממה ולתת תאים לצרף שעה 1 יותר. להיזהר מאוד נע לתאי להימנע לתת פתרון תא להחליק! התאים בתא כי ייהרס אם הפתרון נופל בשלב זה.
- חזור אל תא מכסה המנוע ולהוסיף 20 מ"ל התקשורת.
- מקום בתאי באמבטיה, אלכוהול לנקות כי הוא מכוסה ברדיד אלומיניום (ריססו גם עם אלכוהול). העבר לתאי למתוח חממה (10% CO 2).
- לתאי Secure למכונת למתוח. בואו תאים נוספים לצרף לילה, ולהתחיל למתוח למחרת. (הערה: כאשר לשים בתאי למכונת למתוח, לזכור לנעול את המכשיר במצב "אפס" לפני הצבת תאים, ואז להדק את הגומייה סביב ההילוכים אל תשכח לבטל את נעילת הילוכים לפני הפעלת המכונה.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקללות et al. דיווח לראשונה את השימוש במערכת עבור גירוי מכני של תאים במבחנה באמצעות המצע אלסטומרי גמיש כדי לספק כוח מכני לתאי 1. מאז הפעם, וריאציות רבות על העיצוב הזה כבר הגה מנוצל. מספר מערכות למתוח מכני זמינים מסחרית תחת השם "Flexercell" (Flexcell אינטרנשיונל קורפ), ואילו במעבדות שימוש כלשהו שהותקן התקנים. בפרוטוקול זה וידאו שתיארנו ההתקנה והשימוש במכשיר אחד כזה במעבדה שלנו.
שהותקן "מכונת למתוח" מתואר בפרוטוקול זה נעשה שימוש במחקרים שונים כדי לחקור את ההשפעות של מתח מחזורי uniaxial על סוגי תאים שונים 2,3. מכונת זהו מנגנון צדדי עם פרמטרים מתכווננת כמה שניתן להשתמש בהם עבור מגוון רחב של מחקרים מאמץ מכני. ההתקנה המתוארת להלן מייצג שיטה ייחודית ויציב עבור אספקת המתח מחזורי uniaxial לתאי חסיד בתרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
