चक्रीय अक्षीय तनाव का उपयोग स्टेम कोशिकाओं के यांत्रिक उत्तेजना

Summary

यह व्यापक रूप से समझा जाता है कि शरीर में यांत्रिक बलों सेल भेदभाव और प्रसार को प्रभावित कर सकते हैं. यहाँ हम एक वीडियो अक्षीय चक्रीय तन्यता तनाव देने के लिए लचीला micropatterned substrates पर संवर्धित कोशिकाओं को स्टेम करने के लिए एक कस्टम निर्मित bioreactor उपयोग प्रदर्शन प्रोटोकॉल उपस्थित थे.

Abstract

जैविक ऊतकों के विकास और रखरखाव में यांत्रिक बलों की भूमिका को अच्छी तरह से हड्डी remodeling, मांसपेशियों hypertrophy, और चिकनी मांसपेशी कोशिका plasticity के रूप में कई यंत्रवत् विनियमित घटना सहित प्रलेखित है,. हालांकि, शामिल बलों अक्सर बहुत जटिल और मुश्किल के निगरानी और vivo में नियंत्रण कर रहे हैं. बेहतर कोशिकाओं पर यांत्रिक बलों के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम पक्षपाती लोचदार झिल्ली पर संवर्धित कोशिकाओं के लिए एक अक्षीय चक्रीय तन्यता तनाव को लागू करने के लिए इन विट्रो विधि में एक विकसित किया है. यह विधि एक motorized अभियान रोटर प्रणाली के साथ एक bioreactor वांछित बल को लागू करने के लिए कस्टम डिजाइन का इस्तेमाल करता है. यहाँ हम एक कदम दर कदम वीडियो प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कैसे इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक "खिंचाव चैम्बर" के विभिन्न घटक इस मामले में, micropatterned स्थलाकृति के साथ उन्मुख तनाव की दिशा के साथ कोशिकाओं के लिए एक सिलिकॉन झिल्ली सहित उपस्थित थे. हम भी कक्षों स्टरलाइज़, झिल्ली पर कोशिकाओं बोने, bioreactor में चैम्बर latching, और यांत्रिक पैरामीटर (यानी परिमाण और तनाव की दर) का समायोजन करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन. इस विशेष प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रक्रियाओं सिलिकॉन झिल्ली पर 10 सुक्ष्ममापी व्यापक तनाव की दिशा करने के लिए समानांतर उन्मुख चैनलों के साथ मानव mesenchymal स्टेम सेल बोने के लिए विशिष्ट हैं. हालांकि, तरीकों और इस प्रणाली में प्रस्तुत सामग्री काफी लचीला के लिए इस विषय पर भिन्नरूपों की एक संख्या को समायोजित कर रहे हैं: तनाव दर, परिमाण, अवधि, सेल प्रकार, झिल्ली स्थलाकृति, झिल्ली कोटिंग, आदि सभी वांछित आवेदन या अनुरूप किया जा सकता है परिणाम. यह अक्षीय तन्यता इन विट्रो में कोशिकाओं को लागू तनाव के प्रभावों की जांच के लिए एक मजबूत तरीका है.

Protocol

दिवस 0 - प्रयोग के दिन से पहले बंध्याकरण

1. प्लास्टिक के टब में सामग्री रखो और 2 घंटे के लिए 70% की शराब के साथ बाँझ:
   • चेम्बर्स
   • Lids
   • फ्रेम्स (सभी 3 टुकड़े)
   • शिकंजा
   • रबर gaskets
   • चिमटा
   • कैंची
   • हेक्स wrenches
2. Aquet साबुन और आसुत जल के साथ साफ़ झिल्ली.
3. 10 मिनट के लिए 70% शराब में झिल्ली Sonicate.
4. प्लास्टिक वर्ग बर्तन में स्वच्छ झिल्ली रखें. यदि नमूनों झिल्ली का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए, कि नमूनों की ओर चेहरा (झिल्ली के एक पक्ष पर स्प्रे शराब और grooves के लिए नीचे चलाने के लिए तरल के लिए देखो) है.
5. 2 घंटे के लिए 70% शराब में शामिल झिल्ली छोड़ो.
6. एल्यूमीनियम पन्नी में कल सुबह autoclaving के लिए पैकेज दस्ताने.
7. आसुत जल में कल autoclaving के लिए 2 (वजन की मात्रा /%) जिलेटिन समाधान (2g/100mL) बनाओ.
8. 2 घंटे 70% शराब में नसबंदी के बाद रातोंरात यूवी के लिए हुड में सभी बहुलक सामग्री और झिल्ली (गैर - Autoclavable सामग्री) स्थान:
   • चेम्बर्स
   • Lids
   • फ्रेम्स (सभी 3 टुकड़े)
   • झिल्ली
9. Autoclavable बैग में शेष सामग्री पैक:
   • शिकंजा
   • रबर gaskets
   • चिमटा
   • कैंची
   • हेक्स wrenches

दिन 1 - खिंचाव कक्षों की सभा

1. आटोक्लेव संदंश, कैंची, हेक्स wrenches, स्क्रू, gaskets, दस्ताने, और जिलेटिन 240 ° एफ पर कुल 20 मिनट के लिए छोटे आटोक्लेव का उपयोग
2. यूवी से झिल्ली निकालें और हे ₂ ~ 1 मिनट के लिए प्लाज्मा (नमूनों ऊपर की ओर) के साथ इलाज.
3. टीसी हुड में जिलेटिन के साथ प्लाज्मा इलाज झिल्ली के नमूनों क्षेत्र को कवर. यूवी के अंतर्गत 30 मिनट के लिए कोट.
4. पीबीएस 2X के साथ प्रत्येक झिल्ली धो लें. 2 धोने के बाद, कुछ पीबीएस झिल्ली पर छोड़ने के लिए उन्हें फिसलन रखने के कक्षों में विधानसभा के लिए आसान है. (भी इस पीबीएस का उपयोग करना चाहिए आसान विधानसभा के लिए gaskets चिकना).
5. कक्षों में झिल्ली इकट्ठा (विधानसभा दौरान autoclaved दस्ताने पहनना)
   1. फ्रेम के दो मुख्य टुकड़े एक एकल स्क्रू का उपयोग कर कनेक्ट.
   2. फ्रेम पलटें और शीर्ष ताकि जिलेटिन लेपित फ्रेम की ओर पक्ष चेहरे (नमूनों क्षेत्र के केंद्र में होना चाहिए) एक झिल्ली पर जगह है.
   3. झिल्ली के प्रत्येक पक्ष पर एक गैसकेट का उपयोग कर फ्रेम करने के लिए सुरक्षित है.
   4. में gaskets प्रेस, कोमल का उपयोग करने के लिए, दबाव भी इतनी के रूप में चीर नहीं झिल्ली.
6. टी बार इकट्ठे फ्रेम संलग्न.
7. फ्रेम और चेंबर में जगह उल्टा फ्लिप. 30 मिनट के लिए फ्रेम और झिल्ली की यूवी पीछे की ओर
8. फ्रेम फिर से फ्लिप, और कक्षों में पेंच (नियंत्रण कक्ष के लिए कोई परिवर्तन नहीं है, लेकिन खिंचाव कक्ष के लिए, दो शिकंजा उपयोग के लिए कक्ष के नीचे करने के लिए फ्रेम के अंत टुकड़ा देते की जरूरत है, और एक पेंच है कि दूर करने की जरूरत है फ्रेम के दो टुकड़े को एक साथ पकड़). 30 मिनट के लिए यूवी सामने की ओर. यकीन है कि झिल्ली अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से सूख रहे हैं, वरना सेल समाधान बोने के दौरान बंद पर्ची सकता है.
9. बीज कोशिकाओं. 3 झिल्ली के एक थाली = क्षेत्र का क्षेत्र है, तो 1 / 3 झिल्ली प्रति मिला हुआ थाली के उपयोग. झिल्ली प्रति सेल समाधान के 1 एमएल का प्रयोग करें. 1.5mL की तुलना में किसी भी अधिक समाधान पर रखना मुश्किल हो जाएगा. नमूनों क्षेत्र पर ही कक्ष समाधान रखो, और विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए समाधान के चारों ओर फैल. कक्षों को कवर करने और कोशिकाओं को 30 मिनट हुड में आरटी के लिए देते हैं.
10. इनक्यूबेटर करने के लिए कक्षों को ले जाएँ और दो कोशिकाओं अधिक 1 घंटे के लिए देते हैं. कक्षों जाने के लिए दे सेल समाधान बंद पर्ची से बचने के बहुत सावधान रहना! उस कक्ष में कोशिकाओं अगर समाधान इस बिंदु पर बंद हो जाता है है बर्बाद हो जाएगा.
11. डाकू चैम्बर वापसी और 20 एमएल मीडिया जोड़ें.
12. शराब साफ टब में प्लेस कक्षों कि एल्यूमीनियम पन्नी (यह भी शराब के साथ छिड़काव) के साथ कवर किया जाता है. कक्षों हटो इनक्यूबेटर (10% सीओ ₂₎ खिंचाव.
13. खिंचाव मशीन में सुरक्षित कक्षों. चलो कोशिकाओं आगे रात भर देते हैं, और अगले दिन पर खिंचाव शुरू. (नोट: जब खिंचाव मशीन में डाल कक्षों, कक्षों रखने से पहले "शून्य" की स्थिति में मशीन, ताला और तब गियर के आसपास रबर बैंड कस याद भूल नहीं मशीन को शुरू करने से पहले गियर अनलॉक) .

Discussion

Banes एट अल. पहले इन विट्रो में कोशिकाओं के यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक लचीला elastomeric सब्सट्रेट का उपयोग करने के लिए ¹ कोशिकाओं को यांत्रिक बल देने के द्वारा एक प्रणाली के उपयोग की सूचना दी . इस समय के बाद से, इस डिजाइन पर कई रूपों कल्पना किया गया है और उपयोग. कई यांत्रिक खिंचाव सिस्टम वाणिज्यिक नाम "Flexercell" (Flexcell इंटरनेशनल कार्पोरेशन) के तहत उपलब्ध हैं, जबकि कुछ प्रयोगशालाओं कस्टम निर्मित उपकरणों का उपयोग करें. इस वीडियो प्रोटोकॉल में हम अपनी प्रयोगशाला में एक ऐसी डिवाइस की स्थापना का उपयोग वर्णन किया है.

कस्टम निर्मित "खिंचाव मशीन" इस प्रोटोकॉल में चित्रित विभिन्न अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है के लिए अलग सेल ^{प्रकार} 2,3 पर एक अक्षीय चक्रीय तनाव के प्रभाव की जांच कर सकते हैं. यह मशीन कई समायोज्य पैरामीटर है कि यांत्रिक तनाव के अध्ययन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ एक बहुमुखी उपकरण है. इस के साथ साथ दर्शाया सेटअप पक्षपाती कोशिकाओं संस्कृति में एक अक्षीय चक्रीय तनाव देने के लिए एक अनूठा और मजबूत विधि का प्रतिनिधित्व करता है.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fungizone	Reagent	Lonza Inc.	17-836R	aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C.
Kanamycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15160-054	50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C.
Gentamicin	Reagent	Lonza Inc.	17-518Z	50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C.
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122	1% final. (Also available from other companies)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11966-025
Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells).