Summary
Это широко известно, что механические силы в организме может влиять на дифференциации и пролиферации клеток. Здесь мы представляем видео-протокол, демонстрирующие использование заказных биореактор для доставки одноосной деформации растяжения циклических со стволовыми клетками, культивируемые на гибких подложках micropatterned.
Abstract
Роль механических сил в развитие и поддержание биологической ткани хорошо документирована, в том числе несколько механически регулируемые такие явления, как костного ремоделирования, мышечной гипертрофии, пластичность и гладкой мышечной клетки. Однако силы, участвующие зачастую крайне сложным и трудным для мониторинга и контроля в естественных условиях. Для того чтобы лучше изучить влияние механических сил на клетки, мы разработали в пробирке способ применения одноосной деформации растяжения циклические к прилипшие клетки культивировали на упругие мембраны. Этот метод использует специально разработанный биореактор с моторизованной камеры ротора система применить желаемую силу. Здесь мы представляем шаг за шагом, видео-демонстрации того, как протокол для сборки различных компонентов каждого "растянуть камера", в том числе, в данном случае, силиконовая мембрана с micropatterned топографии ориентироваться клеток с направлением деформации. Мы также описываем процедуры стерилизации камеры, посев клеток на мембране, фиксации камеры в биореакторе, а также настройка механических параметров (например, величины и скорости деформации). Процедуры, изложенные в данном протоколе, специфичные для посева мезенхимальных стволовых клеток человека на силиконовой мембраны с 10 мкм широкие каналы ориентированы параллельно направлению деформации. Тем не менее, методы и материалы, представленные в этой системе являются достаточно гибкими, чтобы приспособить количество вариаций на эту тему: скорости деформации, величины, продолжительности, типа клеток, мембран топографии, мембранного покрытия и т.д. могут быть адаптированы к нужного приложения или результат. Это надежный метод исследования эффектов одноосной деформации растяжения, примененных к ячейкам в пробирке.
Protocol
День 0 - Стерилизация до дня эксперимента
- Положите материалов в пластиковые ванны и стерилизовать 70% спиртом в течение 2 часов:
- Палатах
- Крышки
- Рамки (все 3 штуки)
- Винты
- Резиновые прокладки
- Щипцы
- Ножницы
- Шестигранные ключи
- Чистая мембран с Aquet мыла и дистиллированной воды.
- Разрушать ультразвуком мембран в 70% спирте в течение 10 минут.
- Место чистой мембраны в пластиковые квадратные блюда. При использовании узорной мембран, убедитесь, что узорной сторона лицевой стороной вверх (спрей алкоголя на одну сторону мембраны и следить за жидкость стекать канавки).
- Оставьте мембраны покрыты 70% спирта в течение 2 часов.
- Пакет перчатки в алюминиевую фольгу для автоклавирования завтра утром.
- Сделайте 2% (вес / объем) раствора желатина (2g/100mL) в дистиллированной воде для автоклавирования завтра.
- После 2 часов стерилизации в 70% спиртом, поместите все полимерных материалов и мембран (не автоклавируемый материалов) в капоте для ночного УФ:
- Палатах
- Крышки
- Рамки (все 3 штуки)
- Мембраны
- Остальные обновления материалов в автоклавируемый мешок:
- Винты
- Резиновые прокладки
- Щипцы
- Ножницы
- Шестигранные ключи
День 1 - Монтаж натяжных камер
- Автоклав щипцы, ножницы, шестнадцатеричные ключи, болты, прокладки, перчатки, и желатин с использованием малых автоклаве при температуре 240 ° F в течение 20 минут общего
- Удалить мембран от УФ и обработать плазмой O 2 (узорные стороной вверх) для ~ 1 минуту.
- В капоте ТС, крышка узорной области плазмы рассматривается мембран с желатином. Пальто 30 минуты под УФ.
- Промыть каждую мембрану с PBS 2X. После второго мытья, оставить некоторые PBS на мембранах, чтобы держать их скользкими, для облегчения сборки в камерах. (Если использовать эту PBS для смазки прокладок для облегчения сборки).
- Соберите мембран в камеры (износ автоклавного перчатки во время сборки)
- Подключение двух основных частей каркаса с помощью одного винта.
- Флип кадр снова и место мембраны на вершине, так что желатин покрытием боковых поверхностей к раме (узорные области должны быть в центре).
- Безопасные мембраны раме с помощью прокладки на каждой стороне.
- Пресс прокладки, используя нежные, даже давление, чтобы не разорвать мембрану.
- Прикрепите собранный кадр T-бар.
- Флип кадра и поместить в камеру с ног на голову. УФ стороне задней раме и мембраны в течение 30 минут
- Флип кадр еще раз, и винт на камеры (без изменений для управления камерой, но для натяжных камеры, необходимо использовать два винта, чтобы прикрепить конец кусок кадра на дно камеры, и необходимо удалить одним винтом, который проведение двух частей кадра вместе). УФ-лицевую сторону в течение 30 мин. Убедитесь, что мембраны полностью высохнуть, прежде чем переходить к следующему шагу, иначе клетка решение может соскользнуть во время посева.
- Семенной клеток. Площадь 1 пластина = 3 Площадь мембраны, так что используйте 1 / 3 от сливной пластины в мембране. Используйте 1 мл клеточной раствора на мембране. Любой более 1,5 мл будет трудно сохранять раствор далее. Положите клетка решение только на узорной области, а также использовать пипетки распространять решения вокруг. Обложка камер и пусть клетки приложить на 30 минут РТ в капюшон.
- Перемещение камеры в инкубатор и пусть клетки прикрепите еще 1 час. Будьте очень осторожны, движущихся камер, чтобы избежать позволяя клетка решение соскользнуть! Клеток в том, что камера будет разрушен, если решение падает в этой точке.
- Вернуться к камере капот и добавить 20 мл СМИ.
- Место камер в спиртовой ванне очищают, которая покрыта алюминиевой фольгой (также распыляются с алкоголем). Перемещение камеры, чтобы растянуть инкубатора (10% CO 2).
- Безопасные камер в растянуть машину. Давайте клетки дальнейшем приложите на ночь, и начать растягивать на следующий день. (Примечание: при вводе в камерах растянуть машину, не забудьте заблокировать машину в «нулевой» позиции перед размещением камер и затяните резинкой вокруг передач Не забудьте разблокировать передач перед запуском машины.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Бэйнс и соавт. первые сообщили об использовании системы для механической стимуляции клеток в пробирке с помощью гибкой подложке эластомерных доставить механической силы к клеткам 1. Начиная с этого времени, много вариаций на эту дизайна были задуманы и реализованы. Несколько механических систем растянуть имеются в продаже под названием "Flexercell" (Flexcell Международная корпорация), в то время как некоторые лаборатории использования заказных устройств. В этом видео протокола мы описали установку и использование одной из таких устройств в нашей лаборатории.
На заказ "растянуть машину", изображенная на этом протоколе была использована в различных исследований для изучения влияния одноосной деформации циклических на разных типах клеток 2,3. Эта машина представляет собой универсальный аппарат с несколькими регулируемыми параметрами, которые могут быть использованы для различных механических исследований штамма. Установка изображенного здесь представляет собой уникальный и надежный способ доставки одноосной деформации на циклическую прилипшие клетки в культуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
