Summary
Saponin-permeabilized הכנה סיבים בשילוב עם ניתוח respirometric זרחון חמצוני מספק הערכה אינטגרטיבית של תפקוד המיטוכונדריה. הנשימה מיטוכונדריאלי במדינות פיזיולוגיים ופתולוגיים יכול לשקף השפעות רגולטוריות שונות, כולל אינטראקציות המיטוכונדריה, מורפולוגיה וביוכימיה.
Abstract
חקירת תפקוד המיטוכונדריה מהווה פרמטר חשוב בפיזיולוגיה של הלב כמו המיטוכונדריה מעורבים במטבוליזם של אנרגיה, סטרס חמצוני, אפופטוזיס, הזדקנות, encephalomyopathies המיטוכונדריה רעילות התרופה. לאור זאת, טכנולוגיות למדוד תפקוד המיטוכונדריה לב יש ביקוש. אחת הטכניקות המעסיקה גישה אינטגרטיבית למדוד תפקוד המיטוכונדריה היא respirometric ניתוח חמצוני (OXPHOS) זירחון.
עקרון הערכה OXPHOS respirometric מושתתת על מדידת ריכוז החמצן ניצול אלקטרודה קלארק. כמו חבילת סיבי permeabilized צורכת חמצן, ריכוז החמצן יורדת לחדר סגור. שימוש נבחר מצע מעכבי-uncoupler פרוטוקולים טיטרציה, האלקטרונים ניתנים אתרים ספציפיים של שרשרת הובלת האלקטרונים, המאפשר הערכה של תפקוד המיטוכונדריה. טכניקות הכנה לפני ניתוח respirometric של תפקוד המיטוכונדריה, מכני וכימי מנוצלים permeabilize sarcolemma של סיבי שריר. Permeabilization כימית מעסיקה saponin סלקטיבי לנקב את קרום התא, תוך שמירה על הארכיטקטורה התאית.
מאמר זה מתאר את השלבים ביסודיות מעורבים בהכנת saponin עור סיבי לב עבור מדידות צריכת החמצן להעריך OXPHOS המיטוכונדריה. בנוסף, פתרון בעיות עצה כמו גם מצעים ספציפי, מעכבי ו uncouplers כי ניתן להשתמש כדי לקבוע את תפקוד המיטוכונדריה באתרים ספציפיים של שרשרת הובלת האלקטרונים מסופקים. חשוב לציין, פרוטוקול המתואר ניתן ליישם בקלות ברקמת הלב ואת השלד של מודלים של בעלי חיים שונים דגימות אנושיות.
Protocol
1. מגיב הכנה
- הפתרון הרפיה ושימור (RP Solution) מוכנה כפי שתואר לעיל עם שינויים קלים 1. בקיצור, פתרון RP מורכב 2.77mM CaK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, imidazole 20mm, 0.5mm dithiothreitol, טאורין 20mm, 50mm K-MES, 6.56 MgCl 2, 5.7mM ATP, phosphocreatine 14.3mM, pH 7.1, מנוכה בטמפרטורת החדר (RT). סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.45-מיקרומטר לעקר. מחלקים ל -15 חלקים מ"ל (Falcon צינורות פוליפרופילן) ולאחסן ב -20 ° C ראה דיון על מתכונים.
- הפתרון Respirometry מיטוכונדריאלי (MiR05) מוכנה כפי שתואר לעיל 2 ומכילה EGTA 0.5mm, 3mm MgCl 2 0.6 H 2 O, טאורין 20mm, 10mm KH 2 PO 4, HEPES 20mm, 1g / L BSA, אשלגן-60mm lactobionate, 110mM , סוכרוז pH 7.1, מנוכה על 30 ° C. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.45-מיקרומטר לעקר. מתחלקים 50 חלקים מ"ל (Falcon צינורות פוליפרופילן) ולאחסן ב -20 ° C. ראה דיון על מתכונים. מסיסות החמצן גורם עבור MiR05 ב 30 ° C ו -37 ° C הוא 0.92 3.
2. רקמות הכנה
א לב סיבים הכנה מכני
- נהלים אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים קלגרי השתמש הוועדה לציית האגודה הקנדית למדעי המעבדה מנחים בעלי חיים לניסויים.
- פריקה צוואר הרחם כדי לשתק את העכבר היא השיטה המועדפת. לחלופין, intraperotineal (IP) הזרקה של קטמין ו xylazine (80 ו 10mg/kg, בהתאמה) או 0.5mg/kg של נתרן pentobarbital יכול להיות מנוהל. הערה: נתרן pentobarbital הוא מעכב הפיך של NADH dehydrogenase (אני מורכבים) 4.
- הסר את הלב למקם אותו צלחת פטרי המכילה את הפתרון RP על הקרח (איור 1A). בזהירות להסיר את כל רקמת החיבור ו / או שומן באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה.
- חותכים את הלב במחצית לאורך מחיצת האף. והבלו 10-25mg משקל רטוב (ww) של רקמה על ידי חיתוך ממשטח endocardium של החדר השמאלי (איור 1B). ודא הוא חתך לאורך אוריינטציה סיבים כדי למזער נזק מכני שריר הלב.
- מניחים את גזור, subsample של רקמות נפרד צלחת פטרי, המכיל את פתרון RP על הקרח. באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה לחתוך את הלב לרצועות אורך לאורך אוריינטציה סיבים בקוטר של 1-1.5mm.
- קצר את רצועות עם אזמל מאמצים של 2-4mm (תרשים 1C).
- באמצעות טיפול קיצוני מלקחיים חדה מכנית צרורות סיבים נפרדים. צרורות סיבים הסופי צריך להכיל לכל היותר 6-8 סיבים, המחוברים על ידי אזורים קטנים של מגע, במשקל של לא יותר מ 5 מג ww. סיבי הלב של 1-3mg ww מומלץ. מבחינה ויזואלית, את רקמת הלב צריך לשנות מאדום המקורי גוון ורוד בהיר (איור 1D).
ב 'לב צרורות סיבים הכנה כימיים
- מניחים צלחת 12-היטב על קרח.
- יש לשטוף היטב (ים) עם פתרון RP כדי למזער את הזיהום סידן 5.
- העברת חבילות סיבים מוכן מוכנית פתרון טוב המכיל 3mL RP קר כקרח עם saponin 50ug / mL. הערה: ריכוז saponin אינו תלוי בכמות הנוכחית שריר הלב בפתרון.
- דגירה עבור 20min עם ערבוב קל על הקרח.
ג Bundle לב סיבים כביסה
- יש לשטוף היטב חדשה עם MiR05 כדי למזער את הזיהום סידן 5.
- העברת חבילות לב אל 10ml היטב המכיל חדשות קר כקרח MiR05. דגירה עבור 10min עם ערבוב קל על הקרח.
- חזור (1-2) 2-3 פעמים עם MiR05 טריים. השלבים כביסה שחוזר על עצמו כדי להבטיח את סילוק או saponin, ATP, ADP מצעים וכל שנותר מן צרורות סיבים.
ד קביעת משקל רטוב
- לפני ישירות ניתוח בדרכי הנשימה, משקל רטוב מתקבל על ידי סופג צרורות סיבים בודדים (1-3mg ww) על משטח סופג (נייר סינון) באמצעות מלקחיים והחזקה של סיבים על פני השטח במשך 5s או עד לחות כל רשע משם.
- שימוש במשטח סופג אחר, להסיר נוזל עודף מלקחיים.
- טרה את קנה המידה ואת המקום על חבילת סיבי פלסטיק לשקול סירה למדידת מסה.
- העברת חבילת סיבי לב היטב חדשה עם קרים כקרח MiR05. צרור סיבי מוכן הערכת צריכת החמצן.
3. ניתוח Respirometric OXPHOS
א Respirometric ציוד
- המעבדה משתמשת וממליצה שני טיטרציה הזרקת oxygraph קאמרית (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros מכשירים). Oxygraph 2-k מציעה respirometry ברזולוציה גבוהה במידה רבה על ידי ניצול חומרה, תוכנה ו אינסטרומנטלי (DatLab) זה ממזער רקע אינסטרומנטלית שתורמיםצריכת החמצן חפצים.
- כיול oxygraph היא צעד חיוני כדי למזער את ההשפעות של צריכת החמצן בלבול אינסטרומנטלי. כיול משתנה מעט בהתאם oxygraph. עיין במדריך למשתמש oxygraph עבור הליכים ספציפיים.
ב נציג הבקרה / טכניקה איכות אימות פרוטוקול
- ודא MiR05 נוספה דיור לתאי oxygraph חיישנים חמצן polarographic (POS) ולתת מספיק זמן הרוויה אוויר איזון של MiR05 ב 37 ° C לפני לשים את סיבי לב Murine לתאי oxygraph.
- הדגימות סיבים לב ממוקמים MiR05 עוררה של בתאי oxygraph. הערה: ודא ברים ומערבבים הם PVDF או הצצה מצופה ברים stirrer (בקוטר 6 מ"מ).
- באמצעות מזרק מלא חמצן, להגדיל את ריכוז החמצן לתאי oxygraph עד 250 550uM. יצוין כי ריכוז החמצן הוא המגביל את ההכנות סיבים permeabilized ב 50% ואפילו מעל האוויר הרוויה 6. אפשר 5-10min לייצוב ריכוז החמצן.
- שימוש microsyringe המילטון 25μL, להוסיף 10μL של גלוטמט 5μL 2M של 800mM Malate לקבל ריכוז סופי של 10mm ו - 2 מ"מ, בהתאמה. Titrations אלו מאפשרות קביעת הבסיס מורכב אני הנתמך הנשימה (המדינה 2, היעדר ADP). השטף חמצן צריך לייצב בתוך 5min של כ טיטרציה. הכנה נכונה צריכה לספק לשעתקו מאוד 2 מצב צריכת החמצן.
- לאחר 2-5min של צריכת החמצן יציב, להוסיף 20μL של ADP 500mm ריכוז סופי של 5 מ"מ (להרוות), באמצעות microsyringe 25μL המילטון, לנשימה (מצב 3) מקסימלי המיטוכונדריה דרך קומפלקס מחקרים מעטים I. להשתמש גבוהה של ריכוז של ADP, עם זאת, חשוב לציין כי הרוויה יותר מ 90% הוא הגיע רק בריכוזים מעל 7 5mm.
- לאחר 2-5min של צריכת החמצן יציב, להוסיף 5μL של 4 מ"מ ציטוכרום C להשיג הריכוז הסופי של 10μM, באמצעות microsyringe 10μL המילטון, לניתוח בקרת איכות של הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה שלמות (OMM).
- לאחר 2-5min של צריכת החמצן יציב, להוסיף 1μL של 4mg / mL oligomycin, באמצעות microsyringe 10μL המילטון, לעכב ATP synthase. זה צעד טיטרציה יציע אימות של תקינות הפנימי קרום המיטוכונדריה.
- בעקבות הערכת respirometric OXPHOS. הדגימה נשמרת עבור משקל יבש או נחישות סמן המיטוכונדריה.
- הסר MiR05 מתאי כוס oxygraph. לשטוף לתאי לפחות שלוש פעמים עם מים מזוקקים (DDH 2 O).
- לשטוף לתאי לפחות שלוש פעמים עם 100% אתנול (EtOH) כדי להסיר EtOH מסיסים כגון מעכבי oligomycin.
- לשטוף את חדרי עם 70% EtOH שלוש פעמים עם EtOH 70% הסופי שנמשך 30 דקות לשטוף לעקר לתאי oxygraph.
- לפני תוספת של MiR05 עבור פרוטוקול חדש טיטרציה ניסיוני להבטיח לתאי המכיל את קופה נשטפים לפחות חמש פעמים עם DDH 2 O.
- Titrations אימות ניתן לבצע כפרוטוקול יחיד (איור 2) או titrations עשוי להיכלל לתוך פרוטוקול מתוכנן היטב טיטרציה בהתאם למטרות ניסויים אבחון המחקרים respirometry.
4. נציג תוצאות:
צריכת החמצן הוכנו כראוי סיבים לב Murine מוערך על ידי פרוטוקול בקרת איכות כפי שמוצג באיור 2. איורים 3-5 דוגמאות בדרך נתקל של סיבי הלב מוכן כראוי. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) מהווה מדד חשוב respirometry. פרמטר זה מציין את הצימוד בין צריכת חמצן זרחון חמצוני. בכל הכנות סיבים permeabilized, RCR הוא שיעור של הנשימה יחסית 3 למדינה 2 או לחילופין על מצב המדינה 3 4 (הנגרמת על ידי oligomycin ו / או atractyloside, ATR). יתר על כן, RCR יכול לשמש כסמן אבטחת איכות יכולים לזהות שינויים צימוד הנובע התערבויות ניסיוניות או פתולוגי 5. ובכן מצמידים ההכנות permeabilized לב Murine תשואה RCR בין 3-6 בהתאם הפתרון הדגירה מנוצל 1, 8, 9.
טיטרציה של ציטוכרום C משמש אימות הכנה רקמות תקין. ציטוכרום C הוא חלבון הנמצא בחלל intermembrane על הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה 10. כאשר הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה הוא תמים, אנדוגני ציטוכרום C נותרת בחלל intermembrane ואת טיטרציה של אקסוגניים ציטוכרום C יש השפעה זניחה על הנשימה (איור 2). אם הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה פגום, אנדוגני ציטוכרום C יכול להשתחרר מן המרחב intermembrane וגם ימנע הנשימה עד אקסוגניים ציטוכרוםג נוסף (איור 3). היערכות נכונה צריך ניסיון רק הגבהה קלה השטף חמצן הבאים בנוסף ג ציטוכרום בטווח 5-15 5%. בנוסף, זו טיטרציה ניסיוני מאפשר הערכה של השפעת הלחץ של פתולוגיות או ניסיוני על תקינות המיטוכונדריה הממברנה החיצונית. אם אפקט ג ציטוכרום מנוסה, להבטיח טיפול במהלך הכנת מכניות של רקמות ו / או להפחית את ריכוז saponin.
התוספת של oligomycin ו / או ATR משמש כדי להעריך שינויים בנשימה דליפה; צריכת החמצן לא תורם זרחון ADP 11. בנוסף, בשלב זה טיטרציה עשוי לשמש אימות של הכנת המדגם הנכון. סיבים הבקרה או wild-type צריך להיות רגיש זה, בנוסף לחוות הפחתה משמעותית של שטף חמצן. RCR נמוך רגישות מופחתת oligomycin ו / או ATR וכתוצאה מכך שטף חמצן גבוהות יחסית מצביע על פגיעה בקרום הפנימי של המיטוכונדריה במהלך ההכנה (איור 4). הנזק הנגרם הוא סביר במהלך הפרדה מכני של סיבי הלב כמו קרום המיטוכונדריה הפנימית היא פחות רגישים עלבון על ידי קרוב משפחה saponin הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. עם זאת, הן הכנה מכני כימי עשוי להיות מותאמים בהתאם כדי למנוע סיבי הלב מוכן כראוי 5, 12.
Saponin עור צרורות סיבים מעכברים לא צריך להישאר הפתרון RP במשך יותר מ 6 שעות או פתרון MiR05 עבור יותר מ 2h. חוסר התגובה המצע מעכבי-uncoupler titrations כפי שניתן לראות באיור 5 ניתן להצביע על תקופות דגירה ממושכת. לאחר מאמצים צריך למזער בתקופות שבין להקריב בעלי חיים צריכת חמצן מדידות.
באיור 1. הכנה מכנית של Murine צרורות סיבים לב. א לב שלם מיד לאחר דיסקציה. ב מדגם 10-25mg של החדר השמאלי הקדמי. רקמת לב ג מופרדים בקוטר 1mm ו 2-4mm רצועות אורך. ד סופי סיבים חבילות לב מוכן permeabilization כימיים עם saponin.
איור 2. תוצאות נציג הכנה נאותה רקמות ניצול הערכה polarographic. 2 המדינה השטף חמצן נתמך על ידי מורכב אני מצעים גלוטמט Malate (M / G) מגורה בצורה משמעותית בעקבות תוספת של ADP (מצב 3). אין אפקט של גירוי בנוסף אקסוגניים ג ציטוכרום מצביע על קרום המיטוכונדריה החיצוני הוא ללא פגע. רגישות של צריכת חמצן oligomycin מרמז על שלמות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה הוא תמים. ריכוז החמצן בחדר סגור 2 מ"ל מזוהה על ידי הקו הכחול. צריכת החמצן של המדגם ברקמת הלב בתוך תא סגור 2 מ"ל מיוצג על ידי הקו האדום. Malate ו גלוטמט, M / G; Diphosphate אדנוזין, ADP, ציטוכרום C, Cyto ג; Oligomycin, o.
3. איור ציטוכרום השפעה ג אימות מבחן ניצול הערכה polarographic. 2 המדינה השטף חמצן נתמך על ידי מורכב אני מצעים גלוטמט Malate (M / G) מגורה בצורה משמעותית בעקבות תוספת של ADP (מצב 3). האפקט של גירוי בנוסף אקסוגניים ג ציטוכרום מצביע על שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה נפגעת. ריכוז החמצן בחדר סגור 2 מ"ל מזוהה על ידי הקו הכחול. צריכת החמצן של המדגם ברקמת הלב בתוך תא סגור 2 מ"ל מיוצג על ידי הקו האדום. Malate ו גלוטמט, M / G; Diphosphate אדנוזין, ADP, ציטוכרום C, Cyto ג
איור 4. יושרה פנימית המיטוכונדריה קרום אימות מבחן ניצול הערכה polarographic. 2 המדינה השטף חמצן נתמך על ידי מורכב אני מצעים גלוטמט Malate (M / G) גירוי חלשה יחסית של צריכת החמצן הבאה תוספת של ADP (מצב 3). רגישות ירודה של צריכת חמצן oligomycin מצביע על קרום המיטוכונדריה הפנימי פגום. ריכוז החמצן בחדר סגור 2 מ"ל מזוהה על ידי הקו הכחול. צריכת החמצן של המדגם ברקמת הלב בתוך תא סגור 2 מ"ל מיוצג על ידי הקו האדום. Malate ו גלוטמט, M / G; Diphosphate אדנוזין, ADP Oligomycin, o.
איור 5. הערכה Polarographic הבאים דגירה ממושכת MiR05. צריכת החמצן הוא רגיש בנוסף אקסוגני של גלוטמט Malate (M / G) צריכת החמצן לאחר תוספת של ADP (מצב 3) מצטמצם. אין אפקט של גירוי בנוסף אקסוגניים ג ציטוכרום ואטימות של צריכת חמצן oligomycin מנוסה. חוסר התגובה תוספות פתרון הדגירה extramitochondrial מציע יציבות תפקודית המיטוכונדריה נפגעת. ריכוז החמצן בחדר סגור 2 מ"ל מזוהה על ידי הקו הכחול. צריכת החמצן של המדגם ברקמת הלב בתוך תא סגור 2 מ"ל מיוצג על ידי הקו האדום. Malate ו גלוטמט, M / G; Diphosphate אדנוזין, ADP, ציטוכרום C, Cyto ג
1. הערות: הכנת מגיב
הכנת הפתרון K EGTA 2 במלאי 100mm
| שם מגיב | הריכוז הסופי (מ"מ) | g/100 מ"ל H 2 O |
| אתילן גליקול-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', נ', tetraacetic חומצה (EGTA) | 100 | 3.805 |
| אשלגן הידרוקסיד (KOH) | 200 | 1.15 |
הערה: התאמת ה-pH 7.4 כדי בטמפרטורת החדר.
הכנת פתרון Ca EGTA 2 במלאי 100mm
| שם מגיב | הריכוז הסופי (מ"מ) | g/100 מ"ל H 2 O | הערות (אופציונלי) |
| אתילן גליקול-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', נ', tetraacetic חומצה (EGTA) | 100 | 3.805 | מחממים עד 80 מעלות צלזיוס ומערבבים בעדינות. |
| סידן קרבונט (קאקו 3) | 100 | 1.001 | ריכוז סידן חייב להיות מדויק כמו סידן מסדיר את הפונקציה של האברונים השונים כולל המיטוכונדריה. ודא solubilization מלאה של כל קאקו 3. הפתרון הסופי חייב להיות שקוף לחלוטין. קאקו 3 מעורבת בתחילה עם EGTA וכמה מים כדי להפעיל את היווצרות של חומצה פחמתית ו 2 אידוי CO. תגובה זו יכולה להיות מואץ על ידי חימום עד 80 ° C. |
| אשלגן הידרוקסיד (KOH) | 200 | 1.15 | לנטרל עם KOH לאחר אידוי של CO 2 הושלם. |
הערה: התאמת ה-pH 7.4 כדי בטמפרטורת החדר.
הכנת הרפיה פתרון לשימור (פתרון RP) 1
| מגיב | הריכוז הסופי (מ"מ) | לליטר | תגובות |
| K 2 EGTA | 7.23 | 72.3 מ"ל | |
| CaK 2 EGTA | 2.77 | 27.7 מ"ל | |
| Imidazole | 20 | 1.36g | |
| Dithiothreitol | 0.5 | ||
| טאורין | 20 | 2.52g | |
| אדנוזין 5'-טריפוספט disodium מימה מלח (ATP) | 5.7 | 3.14g | |
| Phosphocreatine (PCR) | 14.3 | 4.0g | |
| מגנזיום כלורי (MgCl 2) | 6.56 | 0.624g | |
| K-MES | 50 | 14.0g |
הערה: התאמת ה-pH 7.1 כדי בטמפרטורת החדר
הכנת פתרון Respirometry מיטוכונדריאלי (MiR05 פתרון) 2
| מגיב | הריכוז הסופי (מ"מ) | לליטר | הערות (אופציונלי) |
| אתילן גליקול-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', נ', tetraacetic חומצה (EGTA) | 0.5 | 0.190g | משמש chelator של סידן |
| מגנזיום כלוריד hexahydrate (MgCl 2 0.6 H 2 O) | 3.0 | 0.610g | איכות הכנה סיבים לא ניתן לבדוק ללא Mg 2 +. |
| טאורין | 20.0 | 2.502g | טאורין הוא מייצב הממברנה נוגד חמצון. 20mm הוא הריכוז תאיים להציג בלב. |
| אשלגן זרחתי monobasic (KH 2 PO 4) | 10.0 | 1.361g | |
| 20.0 | 4.77g | ||
| אשלגן-lactobionate | 60.0 | 120 מ"ל של 0.5 M K-lactobionate מניות | במלאי 0.5m K-lactobionate: הוסף 35.83 גרם חומצה lactobionic עד 100 מ"ל H 2 O ו-pH 7.0 ל ב RT. התאם את נפח 200 מ"ל עם DDH 2 O. משמש כדי לשכפל את + K ריכוז גבוה תאיים. בעבר שימש KCl, לעומת זאת, גבוה Cl-מעכב תפקוד המיטוכונדריה קריאטין קינז. |
| סוכרוז | 110.0 | 37.65g | משמש אוכל נבלות ROS. |
| שור סרום אלבומין (BSA) | 1g / L | 1g | משמש קרום מייצב, נוגד חמצון, וכן chelator של סידן חומצות שומן חופשיות. |
הערה: התאמת ה-pH עד 7.1 ב 30 ° C
3. הערות: Respirometric ניתוח OXPHOS
בחר ב מצעים, uncouplers ומעכבי
רשימת מצעים נבחרות לניתוח Respirometry מיטוכונדריאלי
| התשתית | [צילומים] | הכנה | נפח מ"ל לכל 2 | [סופי] | תגובות |
| מלח אדנוזין 5'-diphosphate monopotassium dihydrate (ADP) | 500mm | 246mg / mL DDH 2 O. התאם ל-pH 7.1 ב RT. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב 250 aliquots μL. | 20ul | 5mm | כדי לשמור קבוע Mg 2 + + במהלך הניסויים respirometry להוסיף 0.6 mol MgCl 2 / mol ADP. |
| Ascorbate | 800mM | 0.1584g / mL DDH 2 O. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 200 aliquots μL. אור רגיש | 5 μL | 2mm | מעשים כמו המצע כאשר משתמשים במקביל TMPD. חייבים לתקן את השטף חמצן חמצון אוטומטי. |
| ציטוכרום C | 4 מ"מ | 50 מ"ג / מ"ל DDH 2 O. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 250 aliquots μL. | 5 μL | 10uM | |
| ציאניד קרבוניל p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | 0.1mm | 0.254mg/10 מ"ל 100% EtOH. חנות בתוך צלוחיות זכוכית -20 מעלות צלזיוס 500 aliquots μL. | צעדים של μL 1 | מעשים כמו uncoupler. קובע האלקטרון מקסימלי יכולת הובלה וכל מגבלה של הובלת האלקטרונים על ידי מערכת זירחון. | |
| גלוטמט | 2M | 0.3742g / mL DDH 2 O. התאם ל-pH 7.1 ב RT. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 250 aliquots μL. | 10ul | 10mm | מעשים כמו המצע של NADH dehydrogenase (מורכבים אני). |
| Malate | 800mM | 0.1073g / mL DDH 2 O. התאם ל-pH 7.1 ב RT. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 250 aliquots μL. | 5ul | 2mm | מעשים כמו המצע של NADH dehydrogenase (מורכבים אני). לא ניתן לתמוך הנשימה לבד. |
| Pyruvate | 1M | 11mg/0.1 מ"ל DDH 2 O. הכן טריים. | 5 μL | 2.5mm | מעשים כמו המצע של NADH dehydrogenase (מורכבים אני). |
| Succinate | 1000mm | 1.3505g / 5 מ"ל DDH 2 O. התאם ל-pH 7.1 ב RT. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 250 aliquots μL. | 20ul | 10mm | מעשים כמו מצע עבור דהידרוגנז succinate (II מורכב). |
| N, N, N ', N'-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | 200mm | 47.1mg / mL DDH 2 O. הוסף ascorbate 0.8M הריכוז הסופי של 10mm למנוע אוטומטי חמצון חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 200 aliquots μL. | 5 μL | 0.5mm | Autoxidation של פתרון המניה ברור לפי המראה של צבע כחול. מעשים כמו המצע כאשר משתמשים במקביל TMPD. חייבים לתקן את השטף חמצן חמצון אוטומטי. |
רשימת מעכבי נבחרות לניתוח Respirometry מיטוכונדריאלי
| התשתית | [צילומים] | הכנה | לכל כרך לשכת מ"ל 2 | [סופי] | תגובות |
| Antimycin | 5mm | 27.4mg/10 מ"ל 100% EtOH. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 250 aliquots μL. | 1 μL | 2.5μM | אינהיביטור של אנזים Q: ציטוכרום C oxidoreductase (Complex III) </ Td> |
| Atractyloside | 50mm | 40 מג / מ"ל DDH 2 O. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 250 aliquots μL. | 30 μL | 0.75mM | אינהיביטור של ה-ATP synthase. |
| Oligomycin | 4mg / mL | 4mg / ml 100% EtOH. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 200 aliquots μL. | 1 μL | אינהיביטור של ה-ATP synthase. | |
| אשלגן ציאניד | 1M | 65.1mg / mL DDH 2 O. הכן טריים. התאם ל-pH 7.1 ב RT | 1 μL | 1mm | מעכבי מונואמין של ציטוכרום C (IV מורכב). לנצל TMPD הבאים טיטרציה ascorbate לגשת autoxidation. |
| Rotenone | 0.1mm | 0.39mg/10 מ"ל 100% EtOH. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 250 aliquots μL. אור רגיש. | 1 μL | 0.05μM | אינהיביטור של NADH dehydrogenase (אני מורכב). ריכוזים גבוהים יותר עשויים להידרש, לעומת זאת, כדי להפחית את השמירה rotenone בתא להתחיל כמתואר. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקה saponin-permeabilized סיבים לב מציעה פשרה ייחודית בין במבחנה vivo הערכה של צריכת OXPHOS המיטוכונדריה חמצן. היתרונות של שיטה זו כוללים גדל רלוונטיות פיזיולוגיים לעומת המיטוכונדריה מבודד כמו ארכיטקטורה הסלולר נשמרת. בעוד הממברנה הפלסמטית נפגעת, מבנים תאיים קרום המיטוכונדריה כולל 12, 14, reticulum sarcoplasmic 14, myofilaments ואת cytoskeleton 1, 17 נותרו על כנן. יתר על כן, יחסי הגומלין בין המיטוכונדריה לבין cytoskeleton 1, 17 גם הם ללא שינוי. המיטוכונדריה בסיבים permeabilized להראות יציבות מוגברת. סיבים ההכנות מכרסמים ניתן לאחסן קר כקרח פתרונות preservations עבור דגימות סיבים 6 שעות אדם להראות יציבות לתקופה של עד 24 שעות 18,2. ניסיון איזון המיטוכונדריה מהיר עם פתרון הדגירה. זה מאפשר שליטה ישירה על ניתוח אתר ספציפי של שרשרת הובלת האלקטרונים בתגובה מצעים, מעכבי הוסיף uncouplers 1, 5. בנוסף, זו טכניקה באתרו דורש רק כמה מיליגרם של רקמת גוף.
מגבלות הטכניקה saponin עור הסיבים לא ניתן להתעלם. המיטוכונדריה לב הם הטרוגניים, המורכב משתי תת;. Subsarcolemmal ו interfibrillar ב respirometry המיטוכונדריה באתרו מעריך את סך אוכלוסיית המיטוכונדריה ללא יכולת להבחין בין subpopulations 5. בנוסף, מטבוליטים שונים הסלולר וגורמים cytosolic לווסת את תפקוד המיטוכונדריה. רכיבים אלה cytosolic של סיבי לב אובדים בתהליך permeabilization וכתוצאה מכך חוסר היכולת להעריך את המיטוכונדריה המדויק בסביבה vivo 5.
דיווח בעיות הן נושא חשוב. מדידות צריכת חמצן יכול להיות מבוטא בכל משקל רטוב או יבש משקל, לעומת זאת, צפיפות המיטוכונדריה היא גורם מרכזי ההטרוגניות השטף הנשימה כאשר הביע לכל מסת רקמת 7. חשוב להבין כי הפירוש של שיעורי ושינויים בדרכי הנשימה מושפעים במידה רבה על ידי בחירה של מדינה התייחסות. עבור השוואה ישירה של תוצאות OXPHOS respirometric בסיבים permeabilized, שיעורי חייב לבוא לידי ביטוי ביחס סמן התייחסות נפוצות כגון הדנ"א המיטוכונדרי, synthase פעילות ציטרט, פעילות ציטוכרום C אוקסידאז, ו / או תכנים Aa3 ציטוכרום 19.
לסיכום, הכנה סיבים permeabilized להשתמש בשילוב עם ניתוח respirometry מאפשרת להערכת תפקוד אינטגרטיבי של המיטוכונדריה לב. מצבים פתולוגיים שונים מודלים גנטיים יש שימוש בטכניקה זו. אלה כוללים את הערכת רעילות התרופה המושרה, הזדקנות, סוכרת, אי ספיקת לב, פגיעה איסכמית סטרס חמצוני על הפיזיולוגיה המיטוכונדריה 5, 20. מספר ביקורות מתודולוגיות מעולה וכתבי יד של הטכניקה saponin-permeabilized סיבים והערכה polarographic צריכת החמצן פורסמו בעבר 1, 5, 14, 20 והוא מומלץ מאוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מכוני הבריאות הקנדי למחקר הגנום קנדה. JS מחזיק תמיכה משכורת פרסים מן המורשת אלברטה קרן למחקר רפואי לב, ושבץ קרן של קנדה איגוד הסוכרת הקנדית. המעבדה רוצה להכיר סיוע טכני של מכשירים Oroboros במהלך רכישת טכניקה saponin-permeabilized סיבים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).
