Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

Published: February 28, 2011 doi: 10.3791/2431

Summary

Saponina permeabilized preparación de la fibra junto con el análisis de la fosforilación oxidativa respirométrica proporciona una evaluación integradora de la función mitocondrial. Respiración mitocondrial en los estados fisiológicos y patológicos pueden reflejar diferentes influencias regulatorias, incluidas las interacciones mitocondrial, la morfología y la bioquímica.

Abstract

Investigación de la función mitocondrial representa un parámetro importante de la fisiología cardiaca como las mitocondrias están implicadas en el metabolismo energético, el estrés oxidativo, la apoptosis, el envejecimiento, encefalomiopatías mitocondrial y la toxicidad del fármaco. Teniendo en cuenta esto, las tecnologías para medir la función mitocondrial cardiaco están en demanda. Una técnica que emplea un enfoque integral para medir la función mitocondrial es respirométrica fosforilación oxidativa (OXPHOS) análisis.

El principio de la evaluación de la fosforilación oxidativa respirometría se centra en medir la concentración de oxígeno que utiliza un electrodo de Clark. A medida que el haz de fibras permeabilized consume el oxígeno, la concentración de oxígeno en la disminución de cámara cerrada. Utilizando sustrato seleccionado desacoplador inhibidor de los protocolos de valoración, los electrones se proporcionan a sitios específicos de la cadena de transporte de electrones, lo que permite la evaluación de la función mitocondrial. Técnicas de preparación antes del análisis de respirometría de la función mitocondrial, mecánicos y químicos se utilizan para permeabilizar el sarcolema de las fibras musculares. Permeabilización química emplea saponina para perforar de forma selectiva la membrana celular, manteniendo la arquitectura celular.

Este documento describe minuciosamente los pasos a seguir en la preparación de saponina de piel fibras cardiacas para medir el consumo de oxígeno para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial. Además, la solución de problemas asesoramiento, así como sustratos específicos, los inhibidores y desacopladores de que se puede utilizar para determinar el funcionamiento de las mitocondrias en sitios específicos de la cadena de transporte electrónico se proporcionan. Es importante destacar que el protocolo descrito puede aplicarse fácilmente en el tejido cardíaco y esquelético de varios modelos animales y muestras humanas.

Protocol

1. Preparación de los reactivos

  1. La solución de la relajación y la conservación (RP solución) se prepara como se describió anteriormente, con pequeñas modificaciones 1. En pocas palabras, la solución consiste en RP 2.77mM CAK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20 mM imidazol, ditiotreitol 0,5 mM, 20 mM de taurina, 50 mM K-MES, 6,56 MgCl 2, 5,7 mm ATP, fosfocreatina 14,3 mm, pH 7.1, ajustado a temperatura ambiente (TA). Filtrar la solución a través de un filtro de 0,45 micras, para esterilizar. Divida en 15 porciones ml (Falcon tubos de polipropileno) y almacenar a -20 ° C Véase la discusión para las recetas.
  2. La solución de respirometría mitocondrial (MiR05) se prepara como se describió anteriormente 2 y contiene 0,5 mM EGTA, 3 mM de MgCl 2 .6 H 2 O, taurina 20 mM, 10 mM KH 2 PO 4, HEPES 20 mM, BSA 1 g / L, 60 mM de potasio lactobionato, 110 mm sacarosa, pH 7.1, ajustado a 30 ° C. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,45 micras, para esterilizar. Se dividen en porciones de 50 ml (Falcon tubos de polipropileno) y almacenar a -20 ° C. Véase la discusión para las recetas. El factor de solubilidad del oxígeno para MiR05 a 30 ° C y 37 ° C es de 0,92 3.

2. Preparación del tejido

A. cardíaco fibras preparación mecánica

  1. Procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Calgary y Cuidado de Animales del Comité de Uso y cumplir con la Asociación Canadiense de directrices Laboratorio de Ciencias Animales de experimentación.
  2. La dislocación cervical para inmovilizar el ratón es el método preferido. Por otra parte, intraperotineal (IP) de inyección de ketamina y xilazina (80 y 10mg/kg, respectivamente) o 0.5mg/kg de pentobarbital de sodio puede ser administrado. Nota: El pentobarbital sódico es un inhibidor reversible de la NADH deshidrogenasa (complejo I) 4.
  3. Quitar el corazón y colocarlo en un plato de petri-que contiene la solución de RP en el hielo (Figura 1). Retire con cuidado el tejido conectivo y / o grasa usando un microscopio de disección.
  4. Cortar el corazón por la mitad a lo largo del tabique. Los impuestos especiales de 10 a 25mg de peso húmedo (ph) de los tejidos mediante la reducción de la superficie del endocardio del ventrículo izquierdo (fig. 1B). Asegúrese de que la incisión es a lo largo de la orientación de las fibras para minimizar el daño mecánico al miocardio.
  5. Coloque la disección, sub-muestra de tejido en un aparte-petri plato que contiene la solución de RP en el hielo. Utilizando un microscopio de disección cortar el corazón en tiras longitudinales a lo largo de orientación de las fibras con un diámetro de 1 a 1,5 mm.
  6. Acortar las tiras con un bisturí para longitudes de 2 a 4 mm (fig. 1C).
  7. Usando extremo cuidado y unas pinzas afiladas mecánicamente haces de fibras separadas. Paquetes de final de la fibra debe contener un máximo de 6-8 fibras, conectadas por pequeñas áreas de contacto, que no pesen más de 5 mg de peso húmedo. Fibras cardíacas de 1-3mg ww se recomiendan. Visualmente, el tejido cardiaco debe cambiar de color rojo original a un color rosa pálido (Figura 1D).

B. cardíaco preparación de fibras químicas paquetes

  1. Coloque una placa de 12 pozos en el hielo.
  2. Enjuague bien la (s) con la solución de RP para minimizar la contaminación de calcio 5.
  3. La transferencia de los haces de fibras mecánicamente preparado para un pozo que contiene 3 ml helada solución RP con 50ug / ml de saponina. Nota: La concentración de saponina no depende de la cantidad de músculo cardíaco presente en la solución.
  4. Incubar durante 20 minutos con agitación suave en el hielo.

C. fibra cardiaca paquete de lavado

  1. Enjuague un nuevo pozo con MiR05 para minimizar la contaminación de calcio 5.
  2. La transferencia de los paquetes cardiaca a los 10 ml que contiene nuevas y helada MiR05. Incubar durante 10 minutos con agitación suave en el hielo.
  3. Repetir (1-2) 2-3 veces con agua dulce MiR05. Los lavados repetitivos son para garantizar la eliminación o la saponina, ATP, ADP y los sustratos que queda de los haces de fibras.

D. determinación del peso húmedo

  1. Directamente antes del análisis de las vías respiratorias, peso húmedo se obtiene borrando los paquetes de fibras individuales (1-3mg húmedo) sobre una superficie absorbente (papel de filtro) el uso de fórceps y la celebración de la fibra a la superficie durante 5 segundos o hasta que toda la humedad se evacua.
  2. Utilizando otra superficie absorbente, eliminar el exceso de líquido de los fórceps.
  3. Tara la escala y el lugar del haz de fibras de un plástico pesan barco para la medición de la masa.
  4. Transferir el haz de fibras cardíacas de un nuevo pozo con helado de MiR05. El haz de fibras está listo para la evaluación del consumo de oxígeno.

3. Análisis de la fosforilación oxidativa respirometría

A. Equipo de respirometría

  1. El laboratorio utiliza y recomienda una titulación de dos cámaras de inyección oxygraph (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). El Oxygraph 2-k ofrece respirometría de alta resolución en gran parte mediante la utilización de hardware y software instrumentales (DatLab) que minimiza el instrumental de fondo que contribuyen a laartefactos de consumo de oxígeno.
  2. La calibración del oxygraph es un paso esencial para minimizar los efectos de confusión de consumo de oxígeno instrumental. Calibración varía ligeramente en función del oxygraph. Consulte el manual de usuario oxygraph para procedimientos específicos.

B. Calidad de Representante de Control / técnicas de validación de Protocolo

  1. Garantizar MiR05 ha sido añadido a la vivienda oxygraph cámaras los sensores de oxígeno polarográfico (POS) y dar el tiempo suficiente para la saturación del aire y el equilibrio de la MiR05 a 37 ° C antes de poner las fibras cardíacas murino en las cámaras de oxygraph.
  2. Las muestras de fibras cardíacas se colocan en la agitada MiR05 de las cámaras de oxygraph. Nota: Asegúrese de remover las barras son PVDF o PEEK recubierto bares agitador (6 mm de diámetro).
  3. Usando una jeringa llena de oxígeno, aumenta la concentración de oxígeno de las cámaras de oxygraph a 250 550uM. Cabe señalar que la concentración de oxígeno es limitante para la preparación de fibras permeabilized en hasta 50% por encima de saturación del aire 6. Permitir 5-10min para la estabilización de la concentración de oxígeno.
  4. Utilizando una microjeringa Hamilton 25μL, añadir 10μL de glutamato 2M y 5μL de 800 mm de malato de obtener una concentración final de 10 mm y 2 mm, respectivamente. Estas titulaciones permiten la determinación de complejo basal que el apoyo respiratorio (estado 2, la ausencia de ADP). Flujo de oxígeno debería estabilizarse en aproximadamente 5 minutos de la titulación. La preparación adecuada debe proporcionar el estado muy reproducible 2 el consumo de oxígeno.
  5. Después de 2-5 minutos de consumo de oxígeno estable, añadir 20μL de ADP 500 mm para una concentración final de 5 mm (saturación), utilizando una microjeringa Hamilton 25μL, de máxima (estado 3) la respiración mitocondrial a través de complejos estudios de I. Pocos usan esta alta concentración de ADP, sin embargo, es importante tener en cuenta que más del 90% de saturación se alcanza sólo con concentraciones superiores a 5 mM 7.
  6. Después de 2-5 minutos de consumo de oxígeno estable, añadir 5μL de 4 mm de citocromo c para obtener una concentración final de 10μM, utilizando una microjeringa Hamilton 10μL, para el análisis de control de calidad de la membrana mitocondrial externa (OMM), la integridad.
  7. Después de 2-5 minutos de consumo de oxígeno estable, añadir 1μL de 4 mg / mL oligomicina, utilizando una microjeringa Hamilton 10μL, para inhibir la ATP sintasa. Este paso titulación ofrecerá validación de indemnidad de la membrana interna mitocondrial.
  8. Tras la evaluación de la fosforilación oxidativa respirometría. La muestra se mantiene el peso seco o determinación de los marcadores mitocondriales.
  9. Quitar MiR05 de las cámaras de vidrio de la oxygraph. Lave las cámaras de al menos tres veces con agua destilada (DDC 2 O).
  10. Lave las cámaras de al menos tres veces con 100% de etanol (EtOH) para eliminar EtOH solubles, tales como inhibidores de la oligomicina.
  11. Lave las cámaras con EtOH 70% tres veces con el final de EtOH 70% de lavado 30 minutos que dura para esterilizar las cámaras oxygraph.
  12. Antes de la adición de MiR05 para el nuevo protocolo de valoración experimental garantizar las cámaras que contienen los puntos de venta son lavados por lo menos cinco veces con ddH 2 O.
  13. Las valoraciones de validación se puede realizar como un protocolo individual (Figura 2) o titulaciones podrán ser incluidos en un protocolo de valoración bien planificada en función de los objetivos experimentales y de diagnóstico de los estudios de respirometría.

4. Los resultados representativos:

El consumo de oxígeno en las fibras cardiacas debidamente preparado murino es evaluado por el protocolo de control de calidad, como se muestra en la Figura 2. Figuras 3-5 proporcionan ejemplos comúnmente encontrados de forma incorrecta preparado fibras cardiacas. La relación del control respiratorio (RCR) representa un importante índice de respirometría. Este parámetro indica el acoplamiento entre el consumo de oxígeno y la fosforilación oxidativa. En las preparaciones de fibra permeabilized, el RCR es la tasa de respiración en el estado 3 en relación con el estado 2 o, alternativamente, el estado 3 en el estado 4 (inducido por oligomicina y / o atractilosida, ATR). Además, RCR puede ser utilizado como un marcador de garantía de calidad y pueden identificar cambios en el acoplamiento resultantes de las intervenciones experimentales o patológicas 5. Bien preparados junto permeabilized cardiaca murino producir un RCR entre 3-6 dependiendo de la solución de incubación utilizado 1, 8, 9.

La valoración del citocromo c se utiliza como una validación de la preparación del tejido apropiado. Citocromo c es una proteína ubicada en el espacio intermembrana de la membrana mitocondrial interna 10. Cuando la membrana externa de la mitocondria está intacto, el citocromo c endógena se mantiene en el espacio intermembrana y la valoración de los exógenos citocromo c tiene un efecto insignificante en la respiración (Figura 2). Si la membrana externa de la mitocondria está dañada, el endógeno citocromo c puede ser lanzado desde el espacio intermembrana e inhibe la respiración hasta exógena citocromoc Además (Figura 3). La preparación apropiada debe experimentar sólo una ligera elevación en el flujo de oxígeno al citocromo c Además en el rango de 5-15% 5. Además, esta titulación permite experimental para la evaluación de la influencia del estrés patológico o experimentales sobre intacta la membrana mitocondrial externa. Si un efecto de citocromo c se experimenta, garantizar la atención durante la preparación mecánica del tejido y / o reducir la concentración de saponina.

La adición de oligomicina y / o ATR se utiliza para evaluar las alteraciones en la respiración de fugas, consumo de oxígeno no contribuye a la fosforilación de ADP 11. Además, este paso de dosis puede ser utilizado como una validación de la preparación de la muestra adecuada. Las fibras de control o de tipo salvaje debe ser sensible a esta suma y la experiencia de una reducción significativa en el flujo de oxígeno. A RCR bajos y una menor sensibilidad a la oligomicina y / o ATR resultando en un flujo de oxígeno relativamente elevada indica un daño a la membrana mitocondrial interna durante la preparación (Figura 4). Es probable que el daño inducido durante la separación mecánica de las fibras cardíacas, como la membrana mitocondrial interna es menos susceptible a insultar por la saponina en relación a la membrana mitocondrial externa. Sin embargo, tanto la preparación mecánica y química puede tener que ser ajustada en consecuencia para evitar que las fibras cardiacas mal preparados 5, 12.

Los haces de fibras saponina de piel de los ratones no debe permanecer en la solución de RP por más de 6 horas o la solución MiR05 por más de 2 horas. La falta de respuesta a las titulaciones de sustrato-inhibidor desacoplador-como se ve en la Figura 5 puede ser indicativo de los períodos de incubación prolongados. Los esfuerzos posteriores deben reducir al mínimo los períodos entre el sacrificio de los animales y las mediciones de consumo de oxígeno.

Figura 1
Figura 1. La preparación mecánica de murino haces de fibras cardíacas. A. El corazón entero inmediatamente después de la disección. B. Una muestra de 10-25mg del ventrículo izquierdo anterior. C. tejido cardiaco dividido en 1 mm de diámetro y 2 a 4 mm tiras de longitud. D. final haces de fibras cardiacas listo para la permeabilización de la química con saponina.

Figura 2
Figura 2. Los resultados representativos de la preparación del tejido adecuada utilización de la evaluación polarográfico. El estado 2 flujo de oxígeno con el apoyo de glutamato complejo que los sustratos y malato (M / G) y se estimuló significativamente tras la adición de ADP (estado 3). No hay efecto estimulador de la exógena citocromo c indica además la membrana mitocondrial externa está intacta. Sensibilidad del consumo de oxígeno para oligomicina sugiere la integridad de la membrana interna mitocondrial está intacto. La concentración de oxígeno en una cámara de 2 ml cerrado se identifica por la línea azul. El consumo de oxígeno de la muestra de tejido cardiaco en una cámara de 2 ml cerrado se representa por la línea roja. Malato y el glutamato, M / G, difosfato de adenosina, ADP, el citocromo c, c cito; oligomicina, o.

Figura 3
Figura 3. Citocromo c efectos de validación de pruebas de evaluación de la utilización de polarográfico. El estado 2 flujo de oxígeno con el apoyo de glutamato complejo que los sustratos y malato (M / G) y se estimuló significativamente tras la adición de ADP (estado 3). Efecto estimulador de la exógena citocromo c indica además la integridad de la membrana externa mitocondrial se ve comprometida. La concentración de oxígeno en una cámara de 2 ml cerrado se identifica por la línea azul. El consumo de oxígeno de la muestra de tejido cardiaco en una cámara de 2 ml cerrado se representa por la línea roja. Malato y el glutamato, M / G, difosfato de adenosina, ADP, el citocromo c, cito c.

Figura 4
Figura 4. Interior integridad de la membrana mitocondrial prueba de validación de la utilización de la evaluación polarográfico. El estado 2 flujo de oxígeno con el apoyo de glutamato complejo que los sustratos y malato (M / G) y un estímulo relativamente débil del consumo de oxígeno después de la adición de ADP (estado 3). Falta de sensibilidad del consumo de oxígeno a oligomicina sugiere la membrana mitocondrial interna está dañada. La concentración de oxígeno en una cámara de 2 ml cerrado se identifica por la línea azul. El consumo de oxígeno de la muestra de tejido cardiaco en una cámara de 2 ml cerrado se representa por la línea roja. Malato y el glutamato, M / G, difosfato de adenosina, ADP oligomicina, o.

Figura 5
Figura 5. Polarográfica evaluación después de la incubación prolongado en MiR05. El consumo de oxígeno es insensible a la adición exógena de glutamato y malato (M / G) y el consumo de oxígeno después de la adición de ADP (Estado 3) se reduce. No hay efecto estimulador de la exógena citocromo c y la insensibilidad Además del consumo de oxígeno a oligomicina se experimenta. La falta de respuesta a las adiciones a la solución de incubación extramitocondrial sugiere estabilidad funcional mitocondrial se ve comprometida. La concentración de oxígeno en una cámara de 2 ml cerrado se identifica por la línea azul. El consumo de oxígeno de la muestra de tejido cardiaco en una cámara de 2 ml cerrado se representa por la línea roja. Malato y el glutamato, M / G, difosfato de adenosina, ADP, el citocromo c, cito c.

1. Notas: Preparación de los reactivos
Preparación de la solución de archivo K 2 100 mM EGTA

Nombre del reactivo La concentración final (mM) g/100 ml H 2 O
Etilenglicol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) 100 3.805
Hidróxido de potasio (KOH) 200 1.15

Nota: Ajustar el pH a 7,4 a temperatura ambiente.

Preparación de Ca 2 Solución de archivo EGTA 100 mM

Nombre del reactivo La concentración final (mM) g/100 ml H 2 O Comentarios (opcional)
Etilenglicol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) 100 3.805 Calor a 80 ° C y mezclar suavemente.
De carbonato de calcio (CaCO3) 100 1.001 La concentración de calcio debe ser preciso como el calcio regula la función de varios orgánulos como las mitocondrias. Asegurar la solubilización completa de todos los CaCO 3. La solución final debe ser completamente transparente. CaCO 3 es inicialmente mezclado con EGTA y un poco de agua para activar la formación de ácido carbónico y la evaporación de CO 2. Esta reacción puede acelerarse por el calentamiento hasta 80 ° C.
Hidróxido de potasio (KOH) 200 1.15 Se neutraliza con KOH después de la evaporación de CO 2 se ha completado.

Nota: Ajustar el pH a 7,4 a temperatura ambiente.

Preparación de la relajación y la solución de preservación (Solución RP) 1

Reactivo La concentración final (mM) Por litro Comentarios
K 2 EGTA 7.23 72.3 mL
CAK 2 EGTA 2.77 27.7 mL
Imidazol 20 1.36g
Ditiotreitol 0.5
Taurina 20 2.52g
Adenosina 5'-trifosfato disódico sal hidratada (ATP) 5.7 3,14 g
La fosfocreatina (PCr) 14.3 4.0g
Cloruro de magnesio (MgCl 2) 6.56 0.624g
K-MES 50 14.0g

Nota: Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente

Preparación de la solución respirometría mitocondrial (MiR05 solución) 2

Reactivo La concentración final (mM) Por litro Comentarios (opcional)
Etilenglicol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) 0.5 0.190g Se utiliza como un quelante de calcio
Magnesio hexahidrato de cloruro (MgCl 2 .6 H 2 O) 3.0 0.610g La calidad de la preparación de la fibra no se puede probar sin Mg 2 +.
Taurina 20.0 2.502g La taurina es un estabilizador de membrana y antioxidante. 20 mm es la concentración intracelular presente en el corazón.
Potasio fosfato monobásico (KH 2 PO 4) 10.0 1.361g
20.0 4.77g
Potasio lactobionato 60.0 120 ml de 0,5 M
K-lactobionato
valores
0,5 M K-lactobionato: Añadir 35,83 g de ácido lactobiónico a 100 ml de H2O y el pH de 7,0 a temperatura ambiente. Ajuste el volumen a 200 ml con ddH 2 O. Se utiliza para reproducir la alta concentración intracelular de K +. Anteriormente KCl fue utilizado, sin embargo, el alto Cl-inhibe la función mitocondrial de creatina quinasa.
Sacarosa 110.0 37.65g Se utiliza como limpiador ROS.
Albúmina de suero bovino (BSA) 1 g / L 1g Se utiliza como estabilizador de la membrana, antioxidantes y quelantes de calcio y ácidos grasos libres.

Nota: Ajustar el pH a 7.1 a 30 ° C

3. Notas: Análisis de la fosforilación oxidativa respirometría
B. Sustratos Select, desacoplantes y los inhibidores

Lista de los sustratos seleccionados para el análisis mitocondrial respirometría

Sustrato [Archivo] Preparación Volumen por 2 ml [Final] Comentarios
Adenosina 5'-difosfato monopotásico dihidrato de sal (ADP) 500 mm 246mg / ml ddH 2 O. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente. Almacenar a -80 ° C en 250 alícuotas. 20 ul 5mM Para mantener constante Mg 2 + + durante los experimentos de respirometría añadir 0,6 moles de MgCl 2 / ADP mol.
Ascorbato 800 mm 0.1584g / mL ddH 2 O. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 200 mL. Sensible a la luz 5 l 2 mM Actúa como sustrato cuando se utiliza en paralelo con TMPD. Debe corregir para el flujo de oxígeno para la auto-oxidación.
Citocromo C 4mM 50 mg / mL ddH 2 O. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. 5 l 10um
Carbonilo cianuro
p-(trifluorometoxi)
fenilhidrazona (FCCP)
0.1 mM 0.254mg/10 ml EtOH al 100%. Guarde en frascos de vidrio a -20 ° C en 500 alícuotas. Pasos de 1 l Actúa como un desacoplador. Determina la capacidad máxima de transporte de electrones y una limitación del transporte de electrones por el sistema de fosforilación.
Glutamato 2M 0.3742g / mL ddH 2 O. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. 10ul 10 mM Actúa como un sustrato para la NADH deshidrogenasa (complejo I).
Malato 800 mm 0.1073g / mL ddH 2 O. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. 5UL 2 mM Actúa como un sustrato para la NADH deshidrogenasa (complejo I). No se puede apoyar la respiración solo.
Piruvato 1M 11mg/0.1 ml ddH 2 O. Prepare frescos. 5 l 2,5 mm Actúa como un sustrato para la NADH deshidrogenasa (complejo I).
Succinato 1000mm 1.3505g / 5 ml ddH 2 O. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. 20 ul 10 mM Actúa como sustrato de la succinato deshidrogenasa (complejo II).
N, N, N ', N'-tetrametil-
pphenylenediamine
Dihidrocloruro (TMPD)
200 mM 47.1mg / mL ddH 2 O. Añadir ascorbato 0,8 M a una concentración final de 10 mm para evitar la auto-oxidación Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 200 mL. 5 l 0,5 mM Auto-oxidación de la solución madre evidente por la aparición de coloración azul. Actúa como sustrato cuando se utiliza en paralelo con TMPD. Debe corregir para el flujo de oxígeno para la auto-oxidación.

Inhibidores de la lista de seleccionados para el análisis mitocondrial respirometría

Sustrato [Archivo] Preparación Volumen por 2 mL Cámara [Final] Comentarios
Antimicina 5mM 27.4mg/10 ml EtOH al 100%. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. 1 l 2.5μM Inhibidor de la coenzima Q: citocromo c oxidorreductasa (complejo III) </ Td>
Atractilosida 50 mM 40 mg / mL ddH 2 O. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. 30 l 0,75 mm Inhibidor de la ATP sintasa.
Oligomicina 4 mg / mL 4 mg / mL de EtOH al 100%. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 200 mL. 1 l Inhibidor de la ATP sintasa.
Cianuro de potasio 1M 65.1mg / mL ddH 2 O. Prepare frescos. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente 1 l 1 mM Inhibidor del citocromo c oxidasa (complejo IV). Utilizar TMPD siguientes y titulación para acceder a la auto-oxidación del ascorbato.
Rotenona 0.1 mM 0.39mg/10 ml EtOH al 100%. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. Sensible a la luz. 1 l 0.05μM Inhibidor de la NADH deshidrogenasa (complejo I). Las concentraciones más altas puede ser necesario, sin embargo, para reducir la retención de la rotenona en la cámara comenzará como se indica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La técnica de saponina-permeabilized fibras cardiacas ofrece un compromiso único entre in vitro e in vivo en la evaluación del consumo de oxígeno mitocondrial OXPHOS. Ventajas de esta técnica incluyen el aumento de relevancia fisiológica en comparación con las mitocondrias aisladas como la arquitectura celular se conserva. Mientras que la membrana plasmática se degrada, las estructuras intracelulares de membrana como la mitocondria 12, 14, 14 del retículo sarcoplásmico, miofilamentos y el citoesqueleto de 1, 17 se mantienen intactos. Por otra parte, las interacciones entre las mitocondrias y el citoesqueleto 1, 17 son también inalterados. Mitocondrias en las fibras permeabilized muestran una mayor estabilidad. Preparaciones de fibra de roedores se pueden almacenar en helado de soluciones de preservación de las muestras de fibra de 6h y humanos muestran una estabilidad durante un máximo de 24 horas 18,2. Equilibrio experiencia mitocondrias rápido con la solución de incubación. Esto permite un control directo sobre el sitio específico de análisis de la cadena de transporte electrónico en respuesta a los sustratos añadidos, los inhibidores y desacopladores de 1, 5. Además, esta técnica in situ requiere solamente unos pocos miligramos de tejido.

Limitaciones de la técnica de fibra de saponina de piel no puede ser ignorada. Mitocondrias cardíacas son heterogéneos, que consiste en dos subpoblaciones;. Subsarcolemales y interfibrilares En respirometría mitocondrial in situ evalúa la población mitocondrial total sin la capacidad de distinguir entre el 5 subpoblaciones. Además, varios metabolitos celulares y factores citosólica regular la función mitocondrial. Estos componentes citosólicos de las fibras cardíacas se pierden durante el proceso de permeabilización que resulta en la incapacidad de evaluar mitocondrial en el exacto medio ambiente en vivo 5.

Problemas de información son una preocupación importante. Las mediciones de consumo de oxígeno se puede expresar por unidad de peso húmedo o peso seco, sin embargo, la densidad mitocondrial es un factor importante en la heterogeneidad del flujo respiratorio cuando se expresa por una masa de tejidos 7. Es importante entender que la interpretación de las tasas respiratorias y los cambios están muy influidos por la elección del estado de referencia. Para las comparaciones directas de los resultados de la fosforilación oxidativa de las fibras de respirometría permeabilizadas, los precios se expresan en relación con un marcador de referencia común, como el ADN mitocondrial, la actividad de citrato sintasa, citocromo c oxidasa, y / o contenidos aa3 citocromo 19.

En resumen, la preparación de la fibra permeabilizadas se utiliza junto con el análisis de respirometría permite la evaluación de la función integradora de las mitocondrias cardíacas. Diversos estados patológicos y modelos genéticos han utilizado esta técnica. Estos incluyen la evaluación de la toxicidad inducida por drogas, el envejecimiento, diabetes, insuficiencia cardiaca congestiva, lesión isquémica y el estrés oxidativo mitocondrial en la fisiología de 5, 20. Varias excelentes críticas metodológicas y manuscritos de la técnica de fibra de saponina-permeabilized y la evaluación de consumo de oxígeno polarográfico han sido previamente publicados 1, 5, 14, 20 y son muy recomendables.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Canadá Genoma. JS tiene premios salario apoyo de la Fundación del Patrimonio de Alberta para la Investigación Médica, Heart and Stroke Foundation de Canadá y la Asociación Canadiense de Diabetes. El laboratorio desea agradecer la asistencia técnica de los instrumentos de Oroboros durante la adquisición de la técnica de fibra de saponina-permeabilizadas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol Fisher Scientific HC600
70% Ethanol Fisher Scientific HC-1000
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) Sigma-Aldrich A5285
Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free Sigma-Aldrich A-6003
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Ascobic acid Sigma-Aldrich A4403
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma-Aldrich A2383
Atractyloside Sigma-Aldrich A6882
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C4830
Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752
Digitonin Sigma-Aldrich D141
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779
Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E4378
Glutamic acid Sigma-Aldrich 27647
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Ketamine Pfizer Pharma GmbH Ketaset
Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M9272
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) Sigma-Aldrich M9272
Malic acid Sigma-Aldrich M1000
MES Sigma-Aldrich M3671
N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9541
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P5958
Potassium cyanide Fluka 60178
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Sodium Pentobarbital Ceva Sante Animale 1715 138 Conc. 54.7 mg/ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Succinic acid Sigma-Aldrich S3674
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Taurine Sigma-Aldrich T8691
Xylazine Bayer AG Rompun
ddH2O
Ice
Oroboros Oxygraph-2k Oroboros Instruments
Kimwipes VWR international 21905-026
15ml polypropylene centrifuge tubes VWR international 89004-368
50ml polypropylene centrifuge tubes VWR international 89004-364
Straight Jewelers Forceps George Tiemann & Co. 160-50B
Curved Jewelers Forceps George Tiemann & Co. 160-57B
Straight Surgery Scissors George Tiemann & Co. 105-402
Sterile Surgical Blade VWR international BD371610
0.45-μm Syringe filters VWR international CA28145-485
pH meter VWR international CA11388-308
Glass Petri dishes VWR international 89000-300
12-well Polystyrene Tissue Culture Plates VWR international 82050-926
Plate Stirrer VWR international 97042-594
Fisherbrand Microbars Fisher Scientific 14-511-67
Weigh Scale VWR international CA11278-162
10μl Hamilton Micro Syringe Fisher Scientific 14-815-1
25μl Hamilton Micro Syringe Fisher Scientific 14-824-7
50μl Hamilton Micro Syringe Fisher Scientific 14-824-5
Nalgene Squeeze Bottles Wilkem Scientific LNA2407-1000
Polystyrene Weighing Dishes VWR international 89106-750
Dissecting Microscope Olympus Corporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
  2. Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
  3. Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
  4. Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
  5. Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
  6. Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
  7. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
  8. Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
  9. Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
  10. Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
  11. Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
  12. O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
  13. Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
  14. Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
  15. Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
  16. Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
  17. Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
  18. Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
  19. Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
  20. Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).

Tags

Fisiología Número 48 las fibras cardiacas las mitocondrias el consumo de oxígeno el ratón la metodología
Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hughey, C. C., Hittel, D. S.,More

Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers. J. Vis. Exp. (48), e2431, doi:10.3791/2431 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter