Summary
분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.
Abstract
Biofilms, 의료 산업 및 자연 환경 설정에서 찾을 수 표면에 부착된 미생물의 커뮤니티입니다. 사실, biofilm의 생활은 대부분의 환경에서 미생물의 성장의 predominate 모드를 나타냅니다. 성숙 biofilms 몇 가지 뚜렷한 특징이있다. Biofilm의 미생물은 일반적으로 구조와 지역 사회에 보호 기능을 제공합니다 세포외 기질에 둘러싸여 있습니다. biofilm의 성장 미생물은 일반적으로 유체 - 채워진 채널 둘러싸인 macrocolonies (수천개의 세포를 포함)로 구성된 특성 아키텍처를했습니다. Biofilm - 재배 미생물은 또한 임상 관련 항생제를 포함하여 항균 대리인의 범위에 그들의 저항에 대한 악명 있습니다.
microtiter 접시 분석은 biofilm 형성의 초기 단계의 연구를위한 중요한 도구이며,이 분석은 또한 곰팡이 biofilm 형성을 연구하는 데 사용되었지만, 세균성 biofilms 연구 주로 적용되었습니다. 이 분석은 정적, 배치 성장 조건을 사용하기 때문에, 그것은 일반적으로 흐름 전지 시스템과 관련된 성숙한 biofilms의 형성에 대한 허용하지 않습니다. 그러나, 분석이 잘 세포외 다당류의 생산에 관련된 유전자와 같은 biofilm 형성의 개시 (즉, flagella, 필리, adhesins, 주기적 - DI - GMP 바인딩과 대사에 관여하는 효소)에 필요한 여러 가지 요인을 식별에 효과가있다. 또한 게시된 작품은 microtiter 요리 재배 biofilms은 면역 시스템 effectors 이러한 항생제 내성 및 저항을 성숙 biofilms의 일부 속성을 개발 할 것을 나타냅니다.
이 간단한 microtiter 접시 분석은 벽 및 / 또는 microtiter 접시의 바닥에 biofilm의 형성 수 있습니다. 분석의 높은 처리량 자연은 유전자 화면에 유용합니다뿐만 아니라, 다양한 성장 조건 하에서 여러 변종에 의해 시험 biofilm 형성합니다. 이 분석의 변종은 미생물을 포함한 다양한위한 초기 biofilm 형성을 평가하는 데 사용되지만 pseudomonads, 비브리오 cholerae, 대장균, staphylocci, enterococci, mycobacteria 및 곰팡이, 이에 국한되지 않음되었습니다.
프로토콜 여기에서 설명한에서, 우리는 모델 유기체 녹농균의 biofilm 형성을 연구하기 위해이 분석의 사용에 초점을 맞출 것이다. 이 분석에서, biofilm 형성의 범위는 염료 크리스탈 바이올렛 (CV)를 사용하여 측정됩니다. 그러나, 다른 colorimetric 및 신진 대사 얼룩의 번호는 microtiter 접시 분석을 사용하여 biofilm 형성의 부량에 대한보고되었습니다. microtiter 접시 분석의 용이성, 저렴한 가격과 유연성은 biofilms 연구를위한 중요한 도구가되었다.
Protocol
1. Biofilm 성장을
- 야생 형 녹농균이나 풍부한 매체 박 이상의 돌연변이 스트레인 (즉, LB)의 문화를 성장
- biofilm의 assays를위한 새로운 매체로 통해 밤 문화를 희석 1:100. P.위한 표준 biofilm 분석 매체 녹농균이라는 박테리아는 황산 마그네슘, 포도당 및 casamino의 지방산 (표 참조) 보충 M63 최소한의 매체입니다. 대안 biofilm - 증진 적은 planktonic의 성장과보다 강력한 biofilm, 포도당 및 casamino의 지방산을 자극 매체는 유일한 탄소 및 에너지원으로 아르기닌으로 대체 될 수 있듯이.
- 96 잘 접시에 잘 희석 당 100 μL를 추가합니다. 정량 assays을 위해, 우리는 일반적으로 각각의 치료를 위해 4-8 복제 우물을 사용합니다.
- 37 4-24 시간에 대한 microtiter 접시를 품어 ° C.
2. Biofilm 스테 이닝
- 부화 후 판을 뒤집어하고 액체를 흔들어하여 세포를 덤프.
- 물이 작은 욕조에 부드럽게 잠수함 접시 (즉, 욕조 등 P1000 pipetmen에 대한 피펫 팁 상자의 바닥을 사용하여). 물을 흔들어 봐. 이 과정을 다시 한 번 반복합니다. 이 단계는 다음 단계에서 스테인드 수있는 무소속의 세포와 미디어 구성 요소를 제거하는 데 도움이, 그리고 크게 배경 얼룩을 절감.
- microtiter 접시 각 잘하기 위해 물에 크리스탈 바이올렛의 0.1 % 용액 125 μL를 추가합니다. 솔루션을 제작하는 동안 장갑과 실험 복을 착용하십시오. 가루가 hydroscopic하고 쉽게 얼룩의 의류, 피부 등을 그대로 CV를 무게 경우주의하시기 바랍니다
- 10-15 분 상온에서 microtiter 접시를 품어.
- 위에서 설명한대로 물을 욕조에 잠수함이 잠수하여 물 접시 3-4 회 씻어 밖으로 흔들 모든 초과 세포와 염료의 번호판을 제거하기 위해 종이 타월의 스택에 적극적으로 얼룩.
- 거꾸로 microtiter 접시를 켜고 몇 시간 또는 하루에 대한 건조.
- 때 건조 질적 assays 들어, 우물이 사진 수 있습니다.
3. Biofilm을 Quantifying
- 이력서 solubilize하는 microtiter 접시 각 잘 물을 30 % 초산 125 μL를 추가합니다.
- 10-15 분 상온에서 microtiter 접시를 품어.
- 새로운 평면 바닥 microtiter 접시에 solubilized CV 125 μL을 전송합니다.
- 빈으로 물 30 % 아세트산을 사용하여 550 nm의에서 플레이트 판독기에서 흡광도를 계량.
4. 대표 결과 :
그림 1. 녹농균, 모나스 fluorescens 및 포도상 구균에 대한 수행 biofilm 형성 assays에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. P.의 녹농균이라는 박테리아 (8 시간, 37 ° C)의 biofilm와 우물 (A) 측면 볼 수 있습니다. P.의 biofilm와 우물 (B) 측면보기 fluorescens (6 시간, 30 ° C). (C) biofilm의 하향식보기 S.에 의해 형성 평면 바닥 microtiter 플레이트의 구균 (투 웰스, 24 시간, 37 ° C). P. 녹농균이라는 박테리아와 P. fluorescens 모두 운동성이있는 유기체이며, 공기 - 액체 인터페이스에서 biofilm을 형성. S. 구균이 아닌 운동성이있는이고 잘 하단에 biofilm을 형성.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 방법은 미생물 종의 다양한 사용하기 위해 수정할 수 있습니다. 비 운동성이있는 미생물은 일반적으로 우물의 바닥을 준수하면서 운동성이있는 미생물은 일반적으로, 벽 및 / 또는 우물의 바닥을 준수. biofilm 형성 (즉, 성장 매체, 온도, 부화의 시간)에 대한 최적 조건은 각각의 미생물에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. 나는 각각의 접시에 부정적인 컨트롤을 여러 개 수행하는 각각의 변형이나 조건 (4-8)의 복제, 그리고 긍정적인 컨트롤을 포함시키는 것이 좋습니다, 그리고 가능하다면.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
셰리 Kuchma, 피터 뉴웰과 그림 1의 이미지를 제공 로버트 샨크츠 내 주셔서 감사합니다. 이 작품은 GAO에 NIH 부여 R01AI083256 지원했습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Casamino acids | BD Biosciences | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| Microtiter plates | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. |
| Microtiter plate lids | BD Biosciences | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
- Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
- Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
- Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
- Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
- Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
