Summary
ويصف وسائل الفحص السريع لقياس وقت مبكر تشكيل بيوفيلم في البكتيريا والفطريات. يستخدم هذا الأسلوب لوحة microtiter كما التحتية لتشكيل بيوفيلم الميكروبية ، وبيوفيلم هو تصور استخدام الكريستال سلالة البنفسجي. في مقايسة يوفر إما فحص نوعي أو كمي لتشكيل بيوفيلم في وقت مبكر.
Abstract
الأغشية الحيوية هي مجتمعات الميكروبات يعلق على الأسطح ، والتي يمكن العثور عليها في المواقع الطبية والصناعية والطبيعية. في الواقع ، الحياة في بيوفيلم ربما يمثل وضع تسود لنمو الميكروبات في معظم البيئات. الأغشية الحيوية الناضجة لها خصائص متميزة قليلة. وتحاط عادة بيوفيلم الميكروبات عن طريق المصفوفة خارج الخلية التي توفر بنية وحماية للمجتمع. الميكروبات تنمو في بيوفيلم أيضا أن يكون سمة العمارة تتألف عموما من macrocolonies (التي تحتوي على آلاف من الخلايا) محاطة مملوءة بسائل القنوات. بيوفيلم نابعة من الميكروبات هي أيضا سيئة السمعة لمقاومتهم لمجموعة من العوامل المضادة للجراثيم بما فيها المضادات الحيوية ذات الصلة سريريا.
في مقايسة طبق microtiter أداة هامة لدراسة المراحل المبكرة في تشكيل بيوفيلم ، وأنها طبقت بشكل أساسي لدراسة الأغشية الحيوية البكتيرية ، وعلى الرغم من أنه تم أيضا استخدام هذا الاختبار لدراسة تشكيل بيوفيلم الفطرية. لأن هذا الاختبار يستخدم ثابت ، دفعة للنمو الشروط ، فإنه لا يسمح لتشكيل الأغشية الحيوية الناضجة التي ترتبط عادة مع أنظمة الخلية التدفق. ومع ذلك ، فقد تم فحص فعالية في تحديد العديد من العوامل اللازمة لبدء تشكيل بيوفيلم (أي ، سياط ، الشعرة ، adhesins ، والإنزيمات المشاركة في دوري - DI - GMP ملزمة والأيض) ، وكذلك الجينات المسؤولة عن إنتاج السكاريد خارج الخلية. علاوة على ذلك ، يشير إلى أن الأعمال المنشورة الأغشية الحيوية التي تزرع في أطباق microtiter القيام تطوير بعض خصائص الأغشية الحيوية الناضجة ، مثل التسامح ومقاومة للمضادات الحيوية المستجيبات الجهاز المناعي.
هذا الطبق microtiter بسيط يسمح للمقايسة تشكيل بيوفيلم على و / أو الجدار السفلي من صحن microtiter. طبيعة إنتاجية عالية للمقايسة يجعله مفيدا للشاشات الجينية ، وكذلك اختبار تشكيل بيوفيلم عن سلالات متعددة في ظل ظروف النمو المختلفة. وقد استخدمت بدائل من هذا الاختبار في وقت مبكر لتقييم بيوفيلم تشكيل لطائفة واسعة من الميكروبات ، بما في ذلك ولكن ليس على سبيل الحصر ، pseudomonads ، الضمة الكوليرية ، كولاي ، staphylocci ، المعوية ، متفطرات والفطريات.
في البروتوكول الموصوفة هنا ، سوف نركز على استخدام هذا الاختبار لدراسة تشكيل بيوفيلم التي الزائفة الزنجارية الحي النموذجي. في هذا الاختبار ، يتم قياس مدى تشكيل بيوفيلم باستخدام صبغة الكريستال البنفسجي (السيرة الذاتية). ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن عدد آخر من البقع اللونية والتمثيل الغذائي للالكمي لتشكيل بيوفيلم باستخدام مقايسة لوحة microtiter. حققت سهولة وتكلفة منخفضة ومرونة microtiter مقايسة لوحة أنها أداة حاسمة لدراسة الأغشية الحيوية.
Protocol
1. تنامي وجود بيوفيلم
- تنمو ثقافة الزائفة الزنجارية البرية من نوع أو سلالة متحولة بين ليلة في المتوسط الغني (أي LB)
- تمييع الثقافة في أكثر من ليلة 1:100 متوسطة جديدة لفحوصات بيوفيلم. ومقايسة بيوفيلم القياسية المتوسطة لP. الزنجارية هو M63 المتوسطة تستكمل مع الحد الأدنى من كبريتات المغنسيوم ، والجلوكوز والأحماض casamino (انظر الجدول). كما يمكن الاستعاضة عن بيوفيلم المعززة البديلة المتوسطة التي تحفز نمو أقل العوالق وبيوفيلم أكثر قوة ، والجلوكوز والأحماض casamino مع أرجينين مثل وحيد للكربون ومصدر الطاقة.
- إضافة 100 ميليلتر من تخفيف لكل بئر 96 في طبق بشكل جيد. لالمقايسات الكمية ، ونحن عادة استخدام الآبار 4-8 تكرار لكل علاج.
- احتضان لوحة microtiter ل24/04 ساعة عند 37 درجة مئوية.
2. تلطيخ للبيوفيلم
- بعد مرور فترة الحضانة ، تفريغ خارج الخلايا من خلال تحويل لوحة على والرج السائل.
- بلطف يغرق لوحة صغيرة في حوض من الماء (أي استخدام غيض من مربعات قيعان ماصة للP1000 pipetmen والحوض). نفض الماء. كرر هذه العملية مرة ثانية. هذه الخطوة تساعد على إزالة الخلايا غير مرتبط والمكونات وسائل الاعلام التي يمكن الملون في الخطوة التالية ، ويخفض بشكل كبير تلوين الخلفية.
- إضافة 125 ميكرولتر من محلول 0.1 ٪ من الكريستال البنفسجي في الماء إلى كل بئر من لوحة microtiter. ارتداء قفازات ومعطف مختبر في حين جعل الحل. الحذر عند استخدام وزنها من السيرة الذاتية كما هو مسحوق hydroscopic البقع بسهولة والملابس ، والجلد ، الخ.
- احتضان لوحة microtiter في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
- شطف لوحة 3-4 مرات مع غمر المياه في حوض من الماء على النحو المبين أعلاه ، ونفض لطخة بقوة على كومة من مناشف ورقية للتخلص من لوحة كل الخلايا الزائدة وصباغة.
- بدوره لوحة microtiter رأسا على عقب والجافة لبضع ساعات أو طوال الليل.
- للفحوصات النوعية ، ويمكن تصويرها عند الآبار الجافة.
3. قياس بيوفيلم
- إضافة 125 ميليلتر من حمض الخل 30 ٪ في كل بئر ماء لوحة من لmicrotiter solubilize السيرة الذاتية.
- احتضان لوحة microtiter في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
- نقل 125 ميكرولتر من السيرة الذاتية solubilized إلى شقة جديدة طبق microtiter القاع.
- قياس الامتصاصية في قارئ لوحة عند 550 نانومتر باستخدام حمض الخليك بنسبة 30 ٪ في ماء فارغة.
4. ممثل النتائج :
الشكل 1. يظهر نتيجة لممثل فحوصات أجريت لتشكيل بيوفيلم الزائفة الزنجارية ، الزائفة المتألقة والمكورات العنقودية الذهبية. (أ) عرض الجانب من البئر مع بيوفيلم من الزنجارية P. (8 ساعات و 37 درجة مئوية). (ب) وعرض الجانب من البئر مع بيوفيلم من P. المتألقة (6 ساعات و 30 درجة مئوية). (ج) شكلت وجهة نظر من أعلى إلى أسفل من بيوفيلم س. المذهبة في لوحة مسطحة القاع microtiter (بئرين ، 24 ساعة و 37 درجة مئوية). P. والزنجارية P. المتألقة كلاهما الكائنات متحركة وتشكيل بيوفيلم في واجهة الهواء السائل. S. المذهبة وغير متحركة ، وتشكل بيوفيلم في قاع البئر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تعديل هذه الطريقة للاستخدام مع طائفة واسعة من الأنواع الجرثومية. الميكروبات متحركة تلتزم عادة على الجدران و / أو قيعان الآبار ، بينما غير متحركة الميكروبات تلتزم عادة إلى أسفل الآبار. يجب تحديد الظروف المثلى لتشكيل بيوفيلم (أي نمو متوسطة ، ودرجة الحرارة ، والوقت من الحضانة) تجريبيا لكل ميكروب. أوصي أداء متعددة متماثلة لكل سلالة أو شرط (4-8) ، وبما في ذلك مراقبة إيجابية ، وإذا أمكن ، لمراقبة سلبية على كل لوحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بي بفضل كوتشما شيري ، وروبرت بيت نيويل السيقان لتقديم الصور في الشكل 1. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AI083256 لغاو
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Casamino acids | BD Biosciences | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| Microtiter plates | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. |
| Microtiter plate lids | BD Biosciences | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
- Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
- Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
- Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
- Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
- Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
