Summary
De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.
Abstract
Biofilms zijn gemeenschappen van microben aan oppervlakken, die kan worden gevonden in de medische, industriële en natuurlijke omgeving. In feite is het leven in een biofilm is waarschijnlijk de overhand modus van de groei van microben in de meeste omgevingen. Ouder biofilms hebben een paar duidelijke kenmerken. Biofilm microben worden meestal omgeven door een extracellulaire matrix die structuur en bescherming aan de gemeenschap biedt. Microben groeien in een biofilm hebben ook een karakteristieke architectuur in het algemeen bestaat uit macrocolonies (met duizenden cellen), omringd door met vloeistof gevulde kanalen. Biofilm-grown microben zijn ook berucht om hun verzet tegen een reeks van antimicrobiële middelen met inbegrip van klinisch relevante antibiotica.
De microtiterplaat schotel test is een belangrijk instrument voor de studie van de vroege stadia van biofilmvorming, en is vooral toegepast voor de studie van bacteriële biofilms, hoewel deze test is ook gebruikt om schimmelinfecties te biofilmvorming te bestuderen. Omdat deze test gebruik maakt van statische, batch-groei-omstandigheden, is het niet mogelijk voor de vorming van de volwassen biofilms doorgaans geassocieerd met flow cell-systemen. Echter, de test is effectief bij het identificeren van vele factoren die nodig zijn voor aanvang van de biofilmvorming (dat wil zeggen, flagellen, pili, adhesinen, enzymen die betrokken zijn bij cyclisch-di-GMP binding en metabolisme) en ook genen die betrokken zijn bij extracellulaire polysaccharide productie. Bovendien, gepubliceerd werk geeft aan dat biofilms gekweekt in microtiterplaten gerechten sommige eigenschappen van volwassen biofilms te ontwikkelen, bijvoorbeeld een antibiotica tolerantie en de weerstand tegen het immuunsysteem effectoren.
Deze eenvoudige microtiterplaat gerecht test maakt de vorming van een biofilm op de muur en / of onderkant van een microtiter schotel. De hoge doorvoer aard van de test maakt het nuttig voor genetische screens, evenals het testen van biofilmvorming door meerdere stammen onder verschillende groeiomstandigheden. Varianten van deze test zijn gebruikt om vroegtijdig biofilm vorming te evalueren voor een breed scala van microben, met inbegrip van maar niet beperkt tot, Pseudomonaden, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterokokken, mycobacteriën en schimmels.
In het protocol beschreven, zullen we ons richten op het gebruik van deze test voor het biofilmvorming studie van het modelorganisme Pseudomonas aeruginosa. In deze test, is de mate van biofilmvorming gemeten met behulp van de kleurstof kristalviolet (CV). Er zijn echter een aantal andere colorimetrische en metabole vlekken gemeld voor de kwantificering van biofilmvorming het gebruik van de microtiterplaat test. Het gemak, lage kosten en flexibiliteit van de microtiterplaat test heeft het een instrument van cruciaal belang voor de studie van biofilms.
Protocol
1. Telen van een biofilm
- Grow een cultuur van het wild-type Pseudomonas aeruginosa of mutant stam 's nachts in een rijk medium (dat wil zeggen LB)
- Verdun het 's nachts cultuur 1:100 in de frisse medium voor biofilm assays. Een standaard biofilm voedingsbodem voor P. aeruginosa is M63 minimaal medium aangevuld met magnesium-sulfaat, glucose en casamino zuren (zie tabel). Als alternatief biofilm-bevorderende medium dat minder plankton groei en een meer robuuste biofilm, de glucose en casamino zuren stimuleert kan worden vervangen door arginine als enige koolstof-en energiebron.
- Voeg 100 ul van de verwatering per putje in een 96 goed gerecht. Voor kwantitatieve assays, wij gebruiken meestal 4-8 repliceren putten voor elke behandeling.
- Incubeer de microtiterplaat voor 4-24 uur bij 37 ° C.
2. Kleuren van de biofilm
- Na incubatie, dump die cellen door het draaien van de plaat over en schudden uit de vloeistof.
- Voorzichtig onderdompelen de plaat in een klein bad van water (dat wil zeggen, gebruik maken van de bodems van pipetpunt dozen voor P1000 pipetmen als het bad). Schud uit water. Herhaal dit proces een tweede keer. Deze stap helpt bij het verwijderen losse cellen en media componenten die kunnen worden gekleurd in de volgende stap, en aanzienlijk verlaagt achtergrondkleuring.
- Voeg 125 ul van een 0,1% oplossing van kristalviolet in het water aan elk putje van de microtiterplaat. Draag handschoenen en een laboratoriumjas tijdens het maken van de oplossing. Wees voorzichtig bij het afwegen van de CV als het poeder is hygroscopisch en gemakkelijk vlekken kleding, huid, enz.
- Incubeer de microtiterplaat bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
- Spoel de plaat 3-4 keer met water door onderdompeling in een bad van water, zoals hierboven beschreven, schud uit en dep krachtig op een stapel papieren zakdoekjes om de plaat van alle overtollige cellen en kleurstof te ontdoen.
- Draai de microtiterplaat ondersteboven en droog voor een paar uur of 's nachts.
- Voor de kwalitatieve bepalingen, kan de putten worden gefotografeerd bij het droog.
3. Kwantificering van de biofilm
- Voeg 125 ul van 30% azijnzuur in water aan elk putje van de microtiterplaat om het CV te lossen.
- Incubeer de microtiterplaat bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
- Overdracht 125 pi van het opgeloste CV naar een nieuwe flat bodem microtiterplaten schotel.
- Kwantificeren absorptie in een plaat reader bij 550 nm met behulp van 30% azijnzuur in water als de blanco.
4. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Toont een representatief resultaat voor biofilmvorming testen uitgevoerd voor Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens en Staphylococcus aureus. (A) Een zijaanzicht van de put met een biofilm van P. aeruginosa (8 uur, 37 ° C). (B) Een zijaanzicht van de put met een biofilm van P. fluorescens (6 uur, 30 ° C). (C) Een top-down view van de biofilm gevormd door S. aureus in een vlakke bodem microtiterplaat (twee putten, 24 uur, 37 ° C). P. aeruginosa en P. fluorescens zijn zowel beweeglijk organismen en vormen een biofilm op de lucht-water grensvlak. S. aureus is niet-beweeglijke en vormt een biofilm op de bodem van de put.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode kan worden aangepast voor gebruik met een breed scala van micro-organismen. Beweeglijk microben meestal aan de wanden en / of onderkant van de putten, terwijl niet-beweeglijke microben meestal zich te houden aan de bodem van de putten. De optimale omstandigheden voor biofilmvorming (dat wil zeggen, de groei medium, temperatuur, tijd van incubatie) dient empirisch te worden bepaald voor elke microbe. Ik raad het uitvoeren van meerdere herhalingen voor elke stam of conditie (4-8), met inbegrip van een positieve controle en, indien mogelijk, een negatieve controle op elk bord.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Mijn dank aan Sherry Koetsjma, Pete Newell en Robert Shanks voor het leveren van de beelden in figuur 1. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R01AI083256 naar GAO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Casamino acids | BD Biosciences | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| Microtiter plates | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. |
| Microtiter plate lids | BD Biosciences | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
- Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
- Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
- Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
- Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
- Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
