Summary
Il saggio descrive un modo rapido per misurare la rapida formazione di biofilm in batteri e funghi. Questo metodo utilizza una micropiastra come substrato per la formazione di biofilm microbico, e il biofilm viene visualizzato per mezzo viola ceppo di cristallo. Il saggio fornisce sia un test qualitativo o quantitativo per la formazione di biofilm presto.
Abstract
I biofilm sono comunità di microbi attaccati alle superfici, che si trova in campo medico, industriale e naturale. In realtà, la vita in un biofilm rappresenta probabilmente la modalità predominante di crescita per i microbi nella maggior parte degli ambienti. Biofilm mature hanno alcune caratteristiche distinte. Microbi biofilm sono in genere circondate da una matrice extracellulare che fornisce la struttura e la protezione per la comunità. I microbi che crescono in un biofilm hanno anche una caratteristica architettura generalmente costituiti da macrocolonies (contenente migliaia di cellule) circondato da piene di liquido canali. Biofilm cresciuto microbi sono anche noti per la loro resistenza a una vasta gamma di agenti antimicrobici, inclusi gli antibiotici clinicamente rilevanti.
Il test piatto micropiastra è uno strumento importante per lo studio delle prime fasi di formazione di biofilm, ed è stato applicato principalmente per lo studio dei biofilm batterici, anche se questo test è stato utilizzato anche per studiare la formazione di biofilm fungine. Poiché questo test utilizza statica, batch condizioni di crescita, non consentono la formazione di biofilm maturo tipicamente associati ai sistemi di cella di flusso. Tuttavia, il test si è dimostrato efficace a individuare molti fattori necessari per l'inizio della formazione di biofilm (cioè, flagelli, pili, adesine, enzimi coinvolti nella ciclico-di-GMP vincolanti e metabolismo) e così come i geni coinvolti nella produzione di polisaccaridi extracellulari. Inoltre, opera pubblicata indica che i biofilm cresciuto in piatti microtitolazione si sviluppano alcune proprietà di biofilm maturo, una tale tolleranza agli antibiotici e la resistenza alle effettori del sistema immunitario.
Questo semplice test piatto microtitolazione consente la formazione di un biofilm sulla parete e / o fondo di un piatto di microtitolazione. La natura elevato throughput del test lo rende utile per schermi genetico, così come la formazione di biofilm test da ceppi diversi, in condizioni di crescita diverse. Le varianti di questo test sono stati utilizzati per valutare la formazione di biofilm presto per una grande varietà di microbi, inclusi ma non limitati a, Pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococchi, micobatteri e funghi.
Nel protocollo qui descritto, ci concentreremo sull'uso di questo test per studiare la formazione di biofilm da Pseudomonas aeruginosa organismo modello. In questo saggio, l'estensione della formazione di biofilm è misurata utilizzando il colorante cristal violetto (CV). Tuttavia, una serie di altre macchie colorimetriche e metabolici sono stati segnalati per la quantificazione della formazione di biofilm utilizzando il test micropiastra. L', facilità a basso costo e flessibilità del dosaggio micropiastra ha reso uno strumento fondamentale per lo studio dei biofilm.
Protocol
1. Crescita di un biofilm
- Crescere una cultura della wild-type Pseudomonas aeruginosa o ceppo mutante durante la notte in un terreno ricco (LB cioè)
- Diluire gli oltre 1:100 cultura notte in mezzo fresco per saggi biofilm. Uno standard dosaggio medio biofilm per P. aeruginosa è M63 terreno minimo integrato con solfato di magnesio, glucosio e acidi casamino (vedi tabella). In alternativa biofilm promuovere mezzo che stimola la crescita planctonici meno e un biofilm più robusto, il glucosio e acidi casamino può essere sostituito con arginina come il carbonio e unica fonte di energia.
- Aggiungere 100 microlitri della diluizione per bene in un piatto da 96 pozzetti. Per le analisi quantitative, di solito uso pozzi 4-8 repliche per ogni trattamento.
- Incubare la micropiastra per 4-24 ore a 37 ° C.
2. La colorazione del biofilm
- Dopo l'incubazione, le cellule discarica ruotando la piastra su e scuotendo il liquido.
- Immergere delicatamente la piastra in una vasca d'acqua (ad esempio, utilizzare il fondo delle scatole pipetta punta per P1000 pipetmen come la vasca). Vuotare l'acqua. Ripetere la procedura una seconda volta. Questo passaggio consente di rimuovere le cellule distaccato e componenti multimediali che possono essere colorati nel passaggio successivo, e riduce in modo significativo la colorazione di fondo.
- Aggiungere 125 ml di una soluzione 0,1% del cristalvioletto in acqua per ciascun pozzetto della micropiastra. Indossare guanti ed un camice da laboratorio rendendo la soluzione. Prestare attenzione nel valutare i CV come la polvere igroscopici e facilmente le macchie abbigliamento, pelle, ecc
- Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 10-15 min.
- Risciacquare più volte il piatto 3-4 con l'acqua immergendo in una vasca di acqua come sopra, scuotere vigorosamente e asciugare su una pila di carta assorbente per eliminare la placca di tutte le cellule in eccesso e tintura.
- Girare la micropiastra capovolta e secco per alcune ore o durante la notte.
- Per le analisi qualitative, i pozzetti possono essere fotografati a secco.
3. Quantificare il biofilm
- Aggiungere 125 ml di 30% di acido acetico in acqua in ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione per solubilizzare il CV.
- Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 10-15 min.
- Trasferire 125 microlitri della CV solubilizzato a un nuovo fondo piatto piatto microtitolazione.
- Quantificare assorbanza in un lettore di piastre a 550 nm con 30% di acido acetico in acqua come il vuoto.
4. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Evidenzia un risultato rappresentativo per i test eseguiti per la formazione di biofilm Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens e Staphylococcus aureus. (A) Una vista laterale del bene con un biofilm di P. aeruginosa (8 ore, 37 ° C). (B) Una vista laterale del bene con un biofilm di P. fluorescens (6 ore, 30 ° C). (C) Un top-down vista del biofilm formato da S. aureus in un piatto fondo micropiastra (due pozzi, 24 ore, 37 ° C). P. aeruginosa e P. fluorescens sono entrambi organismi mobili e formano un biofilm all'interfaccia aria-liquido. S. aureus è non-mobili e forma un biofilm sul fondo del pozzo.
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Discussion
Questo metodo può essere modificato per essere utilizzato con una grande varietà di specie microbiche. Microbi mobili tipicamente aderire alle pareti e / o fondo dei pozzi, mentre non mobili microbi tipicamente aderire al fondo dei pozzetti. Le condizioni ottimali per la formazione di biofilm (cioè, terreno di coltura, temperatura, tempo di incubazione) devono essere determinati empiricamente per ogni microbo. Vi consiglio l'esecuzione di più repliche per ogni ceppo o condizione (4-8), e tra un controllo positivo e, se possibile, un controllo negativo su ogni piatto.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
I miei ringraziamenti a Sherry Kuchma, Pete Newell e Robert Shanks per aver fornito le immagini in Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01AI083256 al GAO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Casamino acids | BD Biosciences | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| Microtiter plates | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. |
| Microtiter plate lids | BD Biosciences | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
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