Summary
Le test décrit un moyen rapide pour mesurer la formation de biofilm au début de bactéries et de champignons. Cette méthode utilise une plaque de microtitration comme substrat pour la formation de biofilms microbiens et le biofilm est visualisée en utilisant la souche de cristal violet. Le test fournit soit un test qualitatif ou quantitatif pour la formation de biofilm tôt.
Abstract
Les biofilms sont des communautés de microbes attachés à des surfaces, qui peuvent être trouvés dans les milieux médicaux, industriels et naturels. En fait, la vie dans un biofilm représente probablement le mode prédominant de la croissance des microbes dans la plupart des environnements. Biofilms matures ont quelques caractéristiques distinctes. Microbes biofilm sont généralement entourés d'une matrice extracellulaire qui fournit la structure et la protection de la communauté. Les microbes de plus en plus dans un biofilm ont aussi une architecture caractéristique généralement composé de macrocolonies (contenant des milliers de cellules) entourés par des canaux remplis de fluide. Biofilm cultivés microbes sont également connus pour leur résistance à une gamme d'agents antimicrobiens, y compris des antibiotiques cliniquement pertinents.
Le dosage de plaque de microtitrage est un outil important pour l'étude des premières étapes dans la formation de biofilms, et a été appliquée essentiellement pour l'étude des biofilms bactériens, bien que ce test a également été utilisée pour étudier la formation de biofilms fongiques. Parce que ce test utilise statique, par lots des conditions de croissance, il ne permet pas à la formation des biofilms matures généralement associés aux systèmes de cellule d'écoulement. Cependant, le dosage a été efficace pour identifier les nombreux facteurs requis pour l'initiation de la formation du biofilm (ie, les flagelles, pili, adhésines, enzymes impliquées dans cyclique-di-GMP contraignant et métabolisme) et ainsi que des gènes impliqués dans la production de polysaccharide extracellulaire. Par ailleurs, des travaux publiés indiquent que les biofilms cultivés dans des plaques de microtitrage ne développent certaines propriétés des biofilms matures, une telle tolérance aux antibiotiques et la résistance aux effecteurs du système immunitaire.
Ce test microtitration simples plat permet la formation d'un biofilm sur les parois et / ou fond d'un plat de microtitration. La nature à haut débit de l'essai le rend utile pour les écrans de génétique, ainsi que la formation de biofilms par des souches multiples tests dans des conditions de croissance différentes. Des variantes de ce test ont été utilisés pour évaluer la formation de biofilm tôt pour une grande variété de microbes, y compris mais non limité à, les pseudomonades, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocoques, les entérocoques, les mycobactéries et les champignons.
Dans le protocole décrit ici, nous allons nous concentrer sur l'utilisation de ce test pour étudier la formation de biofilm par le aeruginosa Pseudomonas organisme modèle. Dans cet essai, l'étendue de la formation du biofilm est mesuré en utilisant le colorant cristal violet (CV). Cependant, un certain nombre d'autres taches colorimétriques et métaboliques ont été rapportées pour la quantification de la formation de biofilms en utilisant le dosage de plaque de microtitrage. La facilité, son faible coût et la flexibilité de l'essai de plaque de microtitrage en a fait un outil essentiel pour l'étude des biofilms.
Protocol
1. Growing un biofilm
- Cultiver une culture de l'aeruginosa de type sauvage ou de souche mutante de Pseudomonas pendant la nuit dans un milieu riche (LB-dire)
- Diluer le 1:100 nuit sur la culture dans un milieu frais pour des essais de biofilm. Un milieu de biofilm standards de dosage pour P. aeruginosa est M63 milieu minimal supplémenté avec du sulfate de magnésium, du glucose et des acides casamino (voir tableau). Comme un biofilm-promotion d'autres moyens qui stimule la croissance moins planctoniques et un biofilm plus robuste, le glucose et des acides casamino peut être remplacé par l'arginine comme le carbone unique et source d'énergie.
- Ajouter 100 ul de la dilution par puits dans un plat de 96 puits. Pour les tests quantitatifs, nous avons généralement recours à des puits 4-8 réplicats pour chaque traitement.
- Incuber la microplaque pour 4-24 heures à 37 ° C.
2. La coloration des biofilms
- Après incubation, vider les cellules par retournement de la plaque et en secouant le liquide.
- Doucement plonger la plaque dans une petite baignoire d'eau (à savoir, l'utilisation des fonds des boîtes de pointes de pipette pour P1000 pipetmen que la baignoire). Secouez l'eau. Répétez ce processus une deuxième fois. Cette étape permet d'éliminer les cellules seules et des composants média qui peut être teinté dans la prochaine étape, et réduit considérablement les taches de fond.
- Ajouter 125 ul d'une solution à 0,1% de cristal violet dans l'eau à chaque puits de la microplaque. Porter des gants et une blouse de laboratoire tout en faisant la solution. Faites preuve de prudence lors de la pesée sur le CV que la poudre est hygroscopique et facilement tache les vêtements, la peau, etc
- Incuber la microplaque à température ambiante pendant 10-15 min.
- Rincer la plaque de 3-4 avec de l'eau par immersion dans un bain d'eau comme indiqué ci-dessus, secouer vigoureusement et éponger sur une pile de serviettes en papier pour débarrasser le plateau de toutes les cellules excédentaires et de teinture.
- Tournez la plaque de microtitration à l'envers et sec pendant quelques heures ou jusqu'au lendemain.
- Pour les essais qualitatifs, les puits peuvent être photographiés à l'état sec.
3. Quantifier le biofilm
- Ajouter 125 ul d'acide acétique à 30% dans de l'eau dans chaque puits de la microplaque pour solubiliser le CV.
- Incuber la microplaque à température ambiante pendant 10-15 min.
- Transfert 125 ul du CV solubilisé à un nouveau plat de microtitration à fond plat.
- Quantifier l'absorbance dans un lecteur de plaque à 550 nm en utilisant 30% d'acide acétique dans l'eau comme le vide.
4. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Montre un résultat représentatif pour des essais de formation de biofilm effectué pour Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens et Staphylococcus aureus. (A) Une vue de côté du puits avec un biofilm de P. aeruginosa (8 heures, 37 ° C). (B) Une vue de côté du puits avec un biofilm de P. fluorescens (6 h, 30 ° C). (C) Une vue de haut en bas du biofilm formé par S. aureus dans une plaque de microtitration à fond plat (deux puits, 24 h, 37 ° C). P. aeruginosa et P. fluorescens sont deux organismes motiles et forment un biofilm à l'interface air-liquide. S. aureus est non mobile et des formes un biofilm sur le fond du puits.
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Discussion
Cette méthode peut être modifié pour être utilisé avec une grande variété d'espèces microbiennes. Microbes mobiles généralement adhérer aux parois et / ou fond des puits, tandis que non mobiles microbes normalement adhérer au fond des puits. Les conditions optimales pour la formation du biofilm (ie, le milieu de croissance, température, temps d'incubation) doit être déterminée empiriquement pour chaque microbe. Je vous recommandons d'effectuer plusieurs répétitions pour chaque souche ou la condition (4-8), et notamment un contrôle positif, et si possible, un contrôle négatif sur chaque assiette.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Mes remerciements à Sherry Koutchma, Pete Newell et Robert Shanks pour fournir les images de la figure 1. Ce travail a été soutenu par NIH R01AI083256 au GAO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Casamino acids | BD Biosciences | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| Microtiter plates | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. |
| Microtiter plate lids | BD Biosciences | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
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