Summary
Анализ описывает быстрый способ для измерения раннего образования биопленки у бактерий и грибков. Этот метод использует планшет в качестве субстрата для микробной образование биопленки и биопленки визуализируется использованием штамма кристаллический фиолетовый. Препарат обеспечивает либо качественных или количественных тест для раннего образования биопленки.
Protocol
1. Рост биопленки
- Рост культуры дикого типа синегнойной палочки или мутантный штамм в течение ночи в богатой среде (т.е. LB)
- Развести более 1:100 культуры ночь в свежую среду для биопленки анализов. Стандартной среде анализа биопленки для P. палочки М63 является минимальным среде, дополненной сульфата магния, глюкозы и casamino кислот (см. таблицу). В качестве альтернативы биопленки способствующих среда, которая стимулирует рост менее планктонных и более надежные биопленки, глюкозу и кислоты casamino может быть заменен на аргинин в качестве единственного источником углерода и энергии.
- Добавить 100 мкл разведения на лунку в 96-блюдо. Для количественного анализов, мы обычно используем 4-8 повторить скважин для каждой процедуры.
- Инкубируйте планшет в течение 4-24 часов при 37 ° C.
2. Окрашивание биопленки
- После инкубации дампа клетки, поворачивая пластину снова и вытряхивая жидкости.
- Осторожно погрузите пластину в небольшой ванной воды (то есть использование дне пипетки коробки наконечник для P1000 pipetmen как ванна). Вытряхните воды. Повторите эту процедуру второй раз. Этот шаг поможет удалить одиноких клеток и СМИ компоненты, которые могут быть окрашены в следующем шаге, а также значительно снижает фоновый окрашивания.
- Добавить 125 мкл 0,1% раствора кристаллического фиолетового в воде в каждую лунку планшета. Надевайте перчатки и халат, делая решение. Соблюдайте осторожность при взвешивания резюме в порошок гигроскопичны и легко пятна одежды, кожи и т.д.
- Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
- Промыть пластины 3-4 раза водой путем погружения в ванну с водой, как указано выше, вытряхнуть и промокните энергично на стопку бумажных полотенцах, чтобы избавиться пластина все лишние клетки и красителя.
- Включите планшет с ног на голову и высушить в течение нескольких часов или на ночь.
- Для качественного анализов, скважин можно сфотографироваться в сухом состоянии.
3. Количественная биопленки
- Добавить 125 мкл 30% уксусной кислоты в воде в каждую лунку планшета для растворения резюме.
- Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
- Передача 125 мкл солюбилизированного резюме на новое блюдо с плоским дном микротитровальных.
- Количественная поглощения в ридер при 550 нм с использованием 30% уксусной кислоты в воде, как пустой.
4. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Показывает, представитель результат для образования биопленки анализов проводится для синегнойной палочки, Pseudomonas флуоресцирующей и золотистый стафилококк. (А) вид сбоку и с биопленки П. палочки (8 часов, 37 ° С). (B), вид сбоку и с биопленки П. Циогезсепз (6 часов, 30 ° С). (C) сверху вниз из биопленки образуются С. золотистый в плоскодонных планшет (две скважины, 24 часа, 37 ° С). P. палочки и P. Циогезсепз оба подвижных организмов и форме биопленки на поверхности раздела воздух-жидкость. Золотистого стафилококка является неподвижные и формы биопленки на дне колодца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод может быть модифицирована для использования в самых разнообразных видов микроорганизмов. Подвижные микробы обычно придерживаются стен и / или днища колодцев, в то время как неподвижные микроорганизмы обычно придерживаются на дно скважины. Оптимальные условия для образования биопленки (т.е. ростовой среды, температуры, времени инкубации) должны быть определены эмпирически для каждого микроба. Я рекомендую выполнять несколько повторяет для каждого штамма или состояния (4-8), в том числе и положительного контроля, и, если возможно, отрицательный контроль на каждой пластине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Спасибо Шерри Кучма, Пит Ньюэлл и Роберт Шанкс для обеспечения изображения на рисунке 1. Эта работа была поддержана NIH грант R01AI083256 в ГАО
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | ||
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
(NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
Glucose | Fisher Scientific | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
Casamino acids | BD Biosciences | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
Arginine | Sigma-Aldrich | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
Microtiter plates | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. |
Microtiter plate lids | BD Biosciences | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. |
Crystal violet | Sigma-Aldrich | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
- Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
- Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
- Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
- Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
- Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).