Summary
El ensayo describe un método rápido para medir la formación de biopelículas a principios de bacterias y hongos. Este método utiliza una placa de microtitulación como sustrato para la formación de biopelículas microbianas, y el biofilm se visualiza utilizando la cepa de cristal violeta. El ensayo ofrece ya sea un ensayo cualitativo o cuantitativo de la formación de biofilm temprano.
Abstract
Los biofilms son comunidades de microorganismos adheridos a las superficies, que se puede encontrar en los centros médicos, industriales y naturales. De hecho, la vida en una biopelícula probablemente representa el modo predominante de crecimiento de los microbios en la mayoría de entornos. Biofilms maduros tienen algunas características distintas. Microbios biofilm son típicamente rodeados por una matriz extracelular que proporciona la estructura y la protección a la comunidad. Los microbios que crecen en un biofilm también tienen una arquitectura característica generalmente compuesto por macrocolonies (que contiene miles de células), rodeada de canales llenos de líquido. Biofilm crecido microbios también son conocidos por su resistencia a una amplia gama de agentes antimicrobianos, como los antibióticos clínicamente relevantes.
El ensayo de placa de microtitulación es una herramienta importante para el estudio de las primeras etapas de formación del biofilm, y se ha aplicado principalmente para el estudio de las biopelículas bacterianas, aunque este ensayo también se ha utilizado para estudiar la formación de biopelículas fúngicas. Debido a que esta prueba se utiliza estática, el crecimiento de lotes condiciones, que no permite la formación de las biopelículas maduras típicamente asociados con los sistemas de celda de flujo. Sin embargo, el ensayo ha sido eficaz en la identificación de muchos factores necesarios para el inicio de la formación del biofilm (es decir, los flagelos, pili, adhesinas, enzimas que participan en cíclica-di-GMP vinculante y el metabolismo) y así como los genes implicados en la producción de polisacáridos extracelulares. Además, los trabajos publicados indican que los biofilms cultivadas en placas de microtitulación se desarrollan algunas de las propiedades de los biofilms maduros, con una tolerancia de antibióticos y la resistencia a los efectores del sistema inmune.
Este ensayo de microtitulación plato sencillo permite la formación de un biofilm en la pared y / o fondo de un plato de microtitulación. La naturaleza de alto rendimiento de la prueba lo hace útil para las pantallas de genética, así como la formación de biofilm por pruebas de múltiples cepas en condiciones de crecimiento diferentes. Las variantes de este ensayo se han utilizado para evaluar la formación de biofilm principios para una amplia variedad de microbios, incluyendo pero no limitado a, Pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococos, micobacterias y hongos.
En el protocolo descrito aquí, nos centraremos en el uso de este ensayo para estudiar la formación de biofilm por el organismo Pseudomonas aeruginosa modelo. En este ensayo, la extensión de la formación de biopelículas se mide utilizando el colorante cristal violeta (CV). Sin embargo, una serie de manchas de colorimetría y metabólicas se han reportado para la cuantificación de la formación de biopelículas utilizando el ensayo de placa de microtitulación. La facilidad, bajo coste y la flexibilidad del ensayo de placa de microtitulación se ha convertido en una herramienta fundamental para el estudio de las biopelículas.
Protocol
1. El crecimiento de un biofilm
- Cultivar una cultura de la de tipo salvaje aeruginosa Pseudomonas o cepa mutante durante la noche en un medio rico (LB es decir)
- Diluir el 1:100 noche sobre la cultura en un nuevo medio para los ensayos de biofilm. Un biofilm estándar medio de cultivo de P. aeruginosa es M63 medio mínimo suplementado con sulfato de magnesio, la glucosa y los ácidos casamino (véase el cuadro). Como un biofilm, la promoción de alternativas de medio que estimula el menor crecimiento del plancton y biofilms más robusta, la glucosa y los ácidos casamino puede ser sustituida por arginina como el carbón y la única fuente de energía.
- Añadir 100 ml de la dilución por pocillo en una placa de 96 pocillos. Para los ensayos cuantitativos, por lo general utilizan pozos 4-8 replicar para cada tratamiento.
- Incubar la placa de microtitulación de 4.24 horas a 37 ° C.
2. Tinción de la biopelícula
- Después de la incubación, volcado a las células girando el plato una y sacudir el líquido.
- Suavemente sumergir la placa en una pequeña tina de agua (es decir, utilizar los fondos de cajas de puntas para pipeta P1000 pipetmen como la bañera). Sacuda el agua. Repita este proceso por segunda vez. Este paso ayuda a eliminar las células sueltas y componentes de los medios de comunicación que se puede teñir en el siguiente paso, y reduce significativamente la tinción de fondo.
- Añadir 125 l de una solución al 0,1% de cristal violeta en el agua a cada pocillo de la placa de microtitulación. Use guantes y una bata de laboratorio al hacer la solución. Tenga cuidado al peso de la CV como el polvo es higroscópico y fácilmente las manchas de la ropa, piel, etc
- Incubar la placa de microtitulación a temperatura ambiente durante 10-15 min.
- Enjuague la placa de 3-4 veces con agua por inmersión en una tina de agua como se indicó anteriormente, sacudir y secar con fuerza en una pila de toallas de papel para eliminar la placa de todas las células y el exceso de tinte.
- Gire la placa de microtitulación boca abajo y en seco por unas horas o toda la noche.
- Para los ensayos cualitativos, los pozos pueden ser fotografiados cuando se seca.
3. La cuantificación de la biopelícula
- Añadir 125 l de 30% de ácido acético en agua a cada pocillo de la placa de microtitulación para solubilizar el CV.
- Incubar la placa de microtitulación a temperatura ambiente durante 10-15 min.
- Transferencia de 125 l de la CV solubiliza a un nuevo plato de microtitulación de fondo plano.
- Cuantificar la absorbancia en un lector de placas a 550 nm utilizando 30% de ácido acético en agua como blanco.
4. Los resultados representativos:
Figura 1. Muestra un resultado representativo para los ensayos de la formación del biofilm realizado por Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens y Staphylococcus aureus. (A) A la vista lateral del pozo con un biofilm de P. aeruginosa (8 horas, 37 ° C). (B) A la vista lateral del pozo con un biofilm de P. fluorescens (6 horas, 30 ° C). (C) Una visión de arriba hacia abajo de la formación de biopelículas de S. aureus en una placa de microtitulación de fondo plano (dos pozos, 24 horas, 37 ° C). P. aeruginosa y P. fluorescens son organismos móviles y forman un biofilm en la interfase aire-líquido. S. aureus es no móviles y forma una biopelícula sobre el fondo del pozo.
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Discussion
Este método puede ser modificado para su uso con una amplia variedad de especies microbianas. Microbios móviles suelen adherirse a las paredes y / o en el fondo de los pozos, mientras que los no-móviles microbios normalmente se adhieren al fondo de los pozos. Las condiciones óptimas para la formación de biofilm (es decir, el medio de cultivo, temperatura, tiempo de incubación) debe ser determinada empíricamente para cada microbio. Recomiendo la realización de múltiples repeticiones para cada cepa o condición (4-8), y que incluye un control positivo, y si es posible, un control negativo en cada plato.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Mi agradecimiento a Sherry Kuchma, Pete Newell y Robert Shanks para ofrecer las imágenes en la Figura 1. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención R01AI083256 de la GAO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Casamino acids | BD Biosciences | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| Microtiter plates | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. |
| Microtiter plate lids | BD Biosciences | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
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