Summary
근육 손상을 기본 메커니즘의 확인이 중요합니다. 여기 파라핀 - 임베디드 및 Drosophila 흉부 근육의 부분을 냉동을 준비 histological 기술을 제시한다. 이것은 근육 형태학 및 단백질 및 기타 근육 세포 구성 요소의 로컬 리 제이션의 분석이 가능합니다.
Abstract
인간의 근육 dystrophies 및 myopathies의 분자 특성은 근육 질환 및 근육 사양의 유전자 분석의 복잡도를 발표했다, 모델 시스템의 형성과 기능은 근육 생리에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 따라서, 식별 및 근육 손상을 기초 분자 메커니즘을 특성화하는 것이 중요합니다. 성인 Drosophila 멀티 섬유 근육의 구조는 척추 평형으로 뻗은 줄이있는 근육 1 Drosophila의 유전자 tractability이에게 dystrophic 근육 형태를 분석하고 노화 성인에서 근육 기능에 영향을 미치는 프로세스 2 날아 성격에 큰 시스템을 만들었습니다 유사. 여기 파라핀 - 임베디드 및 Drosophila 흉부 근육의 부분을 냉동을 준비 histological 기술을 제시한다. 이러한 준비는 고전적인 histological 얼룩 물들일와 단백질 검출 염료로 표시되도록 조직을 허용하고, 특히 cryosections 그대로 근육에서 단백질의 immunohistochemical 검출에 이상적입니다. 이것은 근육 조직 구조, 형태학의 결함의 식별, 그리고 근육 / Drosophila 성인 근육의 신경 세포 특정 단백질에 대한 표현 패턴의 감지 분석을 위해 수 있습니다. 이러한 기술은 또한 약간 다른 신체 부위의 sectioning 위해 수정할 수 있습니다.
Protocol
1. 준비
- 갓 3이. 각각 비례 6시 3분 1초에 절대 에탄올, 클로로포름과 빙초산을 결합하여 Carnoy의 정착액을 준비뿐만 아니라 잠수함이 잠수 체포에 대한 모든 솔루션 (추천 시약 섹션을 참조) 유리 얼룩의 단지에 보관해야합니다.
- 준비 알루미늄 호일은 체포에 대한 올바른 크기를 포켓.
- 2 X 40 % 에탄올, 70 % 에탄올, 2 X 100 % 에탄올, methylbenzoate (MB), 50분의 50 V / V MB의 파라핀, 2 X의 파라핀 : 단지를 얼룩에 다음과 같은 솔루션을 준비합니다. 60-65 ° C.에 보육 세트에서 MB의 파라핀 용기를 배치
- 60-65 ° C.에 호일 주머니에 붓다에게 따뜻한 파라핀
2. 목걸이에 파리를 고정
- 당신이 비행에 대한 진입 점을 볼 수있는 수직 위치에 테이프를 사용하여 양안에서 옷깃 4 연결합니다.
- 마취는 얼음 블록을 사용하여 이산화탄소 또는 저체온증을 통해를 사용하여 날아. 파리를 동결하지 않도록주의하십시오.
- 포셉를 사용하여 (날개와 날개 아래 복부 위에 머리와 흉부) 제대로 지향 칼라로 자신의 날개와 자리를 잡아 개별 파리 픽업. 10-20 파리 쉽게 칼라에 맞게해야합니다.
참고 : 여러 genotypes을 분석하는 경우, 칼라 번호와 해당 유전자형의 노트를 만들기 위해 잊지 마세요.
3. Drosophila Thoraxes의 파라핀 섹션
- Carnoy의 솔루션에 대한 칼라를 재배치 4에서 조직을 수정 ° C를 밤이여.
- 고정 후, 에탄올의 농도 증가를 사용하여 샘플을 탈수. 십분 40% (2 회) 70 %와 실온에서 100 % (2 회) 에탄올에 각각의 잠수함 칼라하십시오. 다음 부화의 각 30 분 MB의 메가바이트 + 파라핀 용액 (1:1)의 칼라 및 60-65시 60 분 각 파라핀의 두 가지 변경 사항 ° C.의 칼라를 침투 빠르게 호일 주머니에 칼라를 재배치하고 녹인 (60-65 ° C) 파라핀과 함께 입력합니다. 실온에서 그것을 장소와 파라핀은 (이것은 야간두고하는 것이 가장 좋은 방법입니다) 하드가 될 수 있습니다. 칼라가이 (세로 또는 가로)가 필요 섹션의 방향에 따라 서로 다른 방향에있는 호일 주머니에 놓을 수 있습니다.
- 호일의 체포와 함께 건조 파라핀 블록 포장을 푸는 부드럽게 파라핀 블록에서 칼라를 구분한다. 날카로운 블레이드 또는 메스의 도움으로 조심스럽게 파리 조직 주변에서 엑스트라 파라핀을 잘라 버릴거야.
- 회전 마이크로톰에서 7-10 μm의 섹션 단계로 파라핀 블록을 잘라 상처 조직이 37 ° C 물 목욕으로 평면 떠 수 있습니다. 극지 슬라이드에 sectioned 조직을 놓고 밤 동안 건조 수 있습니다. 이 슬라이드는 hematoxyline과 eosin 염색법과 함께 사용할 수 있습니다 (그림 1A - D), toluidine 파랑, 아닐린 청색 또는 기타 죽어가 조직 구조를 시각화하기 위해뿐만 아니라 항체 얼룩에 관해서는 (그림 1E - E ``).
4. Drosophila Thoraxes의 Cryosections
- 파라핀 섹션과 마찬가지로, 칼라와 패션 알루미늄 호일 주머니에 파리를 준비합니다. 냉동 냉각기가 샘플을 준비하는 데 필요한 것입니다. 쿨러가 -60 주위에 있는지 확인 ° C,이 온도에 도달하도록하기 위해서 약간의 에탄올과 드라이 아이스를 사용합니다. 실험을 시작하기 전에 시간을 진정하고 공기 거품의 형성을 최소화하기 위해 4 ° C 냉장고에 거꾸로 cryo - 퍼가기 매체의 병 (조직 테크 OCT 화합물)을 넣어.
- 냉동 냉각기 내부에 몇 분 동안 미리 냉각 빠르게 cryo - 포함 화합물로 작성되었습니다 호일 주머니에 파리와 칼라를 변경합니다. 30-10 분 샘플 동결하자. 신중하게, 쿨러 내부에 형성된 블록 포장을 푸는 부드럽게 삽입 블록에서 칼라를 별도의 최소한 하루 -20 ° C에 넣어.
- 10-15 μm의의 단면 두께 -15 및 -18 ° C 사이는 cryo - 마이크로톰에 냉동 근육을 잘라. 편광 슬라이드에 삽입하고 추가 처리를 할 준비가 때까지 -20 ° C에서 보관. 우리는 사전에 항체 염색법에 실온에서 10 분 4 %의 포름 알데히드 PBS 용액에 조직을 고정하는 것이 좋습니다.
5. Drosophila 근육의 Lipids 감지
지질 방울은 기름 붉은 O가 지버 및 Thummel 5 채택된 프로토콜을 사용 cryosections에 얼룩로 검색하실 수 있습니다.
- 고정 후, 3 기름 빨간색 O의 H는 상온에서 얼룩을 위해 10 분 및 부화에 대한 프로필렌 글리콜에 equilibrated 5 분에 대해 두 번 물로 슬라이드를 씻으십시오. 다음 프로필렌 글리콜과 PBS에서 30 분 5 분 샘플에게 2 번 씻는다. 30 % 글리세롤에 마운트합니다.
6. 대표 결과 :
무화과우레 1. Parrafin - 임베디드 섹션
간접 비행 근육의 Hematoxyline 및 eosine 스테인드 가로 (AB)와 세로 (CD) 섹션. A와 C는 정상적인 구조 근육을 보여줍니다. 크기와 형태 근육의 비정상는 각각 B와 D (검은색 화살표)에 표시됩니다. (EF) 얼룩 핵 방지 LamC, 핵 봉투 표지와 DAPI와 Drosophila의 흉부 자국의 가로 섹션을 참조하십시오. 정상의 확대 (빨간색 화살표)과 악화 (노란색 화살표) 근육 (F). G는 LamC와 DAPI와 Drosophila 창자 자국의 섹션을 나타냅니다.
그림 2. 냉동 섹션
오일 붉은 O, 지질 방울의 라벨 Drosophila의 흉부 자국의 A. 트랜스 냉동 섹션.
간접 비행 근육의 B. 세로 냉동 섹션 방지 DG, 근육 sarcolemma 마커와 DAPI 물들다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 우리가 cryo - 마이크로톰를 사용할 수에 대한 교수 Eichele 감사합니다. 작품은 맥스 - 플랑크 - Gesselschaft에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel collars | Home made | Specially constructed | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Aluminum foil | Any Supplier | ||
| Blade or scalpel | Any Supplier | ||
| Wheaton macro staining jar | Wheaton | 900200 | |
| Microtome | Carl Zeiss, Inc. | Model: Hyrax M25 | |
| Cryo-microtome | Leica Microsystems | Model CM3050S | |
| 60-65°C Incubator | Any Supplier | Large enough to hold at least 4 staining jars | |
| Freezing cooler with metal block | Any Supplier | Store at -80°C | |
| Super-frost slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9161155 | |
| Cover slips | Any Supplier | Recommend 24 X 40 mm | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Analytical grade |
| Glacial acetic acid | Merck & Co., Inc. | 100063 | Analytical grade |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 100983 | Analytical grade |
| Methylbenzoate | Sigma-Aldrich | M29908-500G | Analytical grade |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | 76258 | Paraffin |
| Tissue-Teck O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 16% formaldehyde, methanol free | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150-1L |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).
- Shcherbata, H. R. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy. The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).
- Kucherenko, M. M. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex. PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. Carnoy fixation: practical and theoretical considerations. Histochemie. 16, 361-36 (1968).
- Ashburner, M. Drosophila - A Laboratory Manual. , CSHL Press. (1989).
- Sieber, M. H., Thummel, C. S. The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila. Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).
