Summary
筋肉の損傷のメカニズムの同定は非常に重要です。ここでは、ショウジョウバエの胸部筋肉のパラフィン包埋して凍結切片を調製するための組織学的手法を提示する。これは筋肉の形態やタンパク質と他の筋肉の細胞成分の局在の分析を行うことができます。
Abstract
ヒトの筋ジストロフィーとミオパシーの分子特性は、筋肉の病気と筋肉の仕様の遺伝学的解析の複雑さを明らかにした、モデルシステムの形成と機能は、筋肉の生理学に貴重な洞察を提供しています。そのため、筋肉の損傷を根底にある分子機構を同定し、特徴付けることが重要です。成人ショウジョウバエマルチファイバーの筋肉の構造は、脊椎動物の横紋筋1とショウジョウバエの遺伝学的従順さがそれをジストロフィー筋の形態を分析し、加齢成人で筋肉機能に影響を与えるプロセスが2便を運行する航空会社の特性に優れたシステムをした似ている。ここでは、 ショウジョウバエの胸部筋肉のパラフィン包埋して凍結切片を調製するための組織学的手法を提示する。これらの製剤は、古典的な組織学的染色で染色し、タンパク質を検出する色素で標識する組織を可能にし、特に凍結切片はそのまま筋肉の蛋白質の免疫組織化学的検出に最適です。これは、筋肉組織の構造、形態学的欠陥の同定、および筋肉/ ショウジョウバエの成体の筋におけるニューロン特異的タンパク質の発現パターンの検出の解析が可能になります。これらの技術はまた、少し他の身体部分の切片用に変更することができます。
Protocol
1。準備
- たて3これは。、無水エタノールを組み合わせることにより、クロロホルム、それぞれの割合午前6時03分01秒の氷酢酸をカルノア固定液を準備するだけでなく、水没の襟のすべてのソリューションは、ガラスの染色瓶（推薦のための試薬 の項を参照）に保管する必要があります。
- 首輪の正しいサイズのアルミ箔のポケットを準備します。
- 2 X 40％エタノール、70％エタノール、2 X 100％エタノール、メチルベンゾエート（MB）、50/50 v / vのMBおよびパラフィン、2 Xのパラフィン：jarを染色では、次の溶液を調製。 60〜65℃にインキュベーターセットのMBとパラフィンの入った容器を置かない
- 60〜65℃に箔のポケットに注いで温かいパラフィン
2。カラーでハエを修正
- その場のためのエントリポイントを見ることができる垂直位置でテープを使用して両眼の下襟を取り付けます4。
- 麻酔は、二酸化炭素を使用して、または氷のブロックを使用して低体温を経由して飛ぶ。ハエを凍結しないように注意してください。
- 鉗子を使用して、（刃と刃下の腹部の上に頭部と胸部）を正しい方向に向けて襟に羽と場所をつかんで、個々のハエを拾う。 10月20日ハエは、簡単に襟に収まる必要があります。
注：複数の遺伝子型を分析している場合は、カラー数と対応する遺伝子型をメモしておくことを忘れないでください。
3。 ショウジョウバエ胸部のパラフィン切片
- カルノア液に襟を再配置し、4℃で組織を固定° Cを一晩。
- 固定後、エタノールの濃度を増加させて使用してサンプルを脱水する。 10分ごとに沈めるために室温で40％（2倍）、70％と100％（2回）エタノールに襟。 [次へ]をインキュベートの各30分間MBとMB +パラフィン溶液（1:1）でのカラーとは、60〜65で60分間ずつパラフィンの二つの変更℃で襟に潜入急速に箔のポケットに襟を再配置し、溶融（60〜65 ° C）パラフィンを詰めます。室温で入れ、パラフィンが（それは一晩おくのが最適です）ハードになることができます。必要なセクション（縦または横）の方向に応じて、カラーが異なる方向に箔のポケットに置くことができることに注意してください。
- 箔から首輪をつけて乾燥したパラフィンブロックをアンラップし、静かにパラフィンブロックから襟を分離。鋭い刃またはメスの助けを借りて、慎重にフライの組織の周りから余分なパラフィンを切り取る。
- 回転ミクロトーム7-10μmのセクションの手順でパラフィンブロックをカットし、カットの組織は37℃の水浴でフラットフロートすることができます。極スライドに組織切片を置き、一晩乾燥できます。これらのスライドは、組織構造を可視化するためにヘマトキシリンおよびエオシン（図1A - D）、トルイジンブルー、アニリンブルーや他の金型と染色のためだけでなく、抗体染色のために使用することができます（図1E - E ``）。
4。 ショウジョウバエ胸部の凍結切片
- パラフィン切片の場合と同様に、襟とファッションアルミ箔のポケットにハエを準備。凍結クーラーは、サンプルを調製するために必要とされる。クーラーは-60程度であることを確認してください° Cを、この温度に到達できるように、少しエタノールとドライアイスを使用してください。実験を開始する前に、時間はそれを冷却すると、気泡の形成を最小限にするために4℃の冷蔵庫に逆さまに低温埋め込み培地のボトル（組織- Tek社のOCT化合物）を置く。
- 凍結クーラー内部の数分間、事前に冷却し、急速凍結包埋化合物でいっぱいにされている箔のポケットにハエと襟を再配置します。 30〜10分間、サンプルの凍結をしてみましょう。慎重に、クーラー内部に形成されたブロックをアンラップそっと埋め込みのブロックから襟を分離し、少なくとも一日は-20℃でそれを置く。
- 10月15日μmの切片厚を-15〜-18℃の間凍結ミクロトームで凍結した筋肉を切り取ります。偏スライド上に配置し、さらに処理を行う準備まで-20℃で保管。我々は、抗体染色の前に室温で10分間、4％ホルムアルデヒドPBS溶液中で組織を固定示唆している。
5。 ショウジョウバエの筋肉の脂質の検出
脂肪滴は、オイルレッドOは、シーバーとThummel 5から採用されたプロトコルを使用して凍結切片を染色で検出することができます。
- 固定後、オイルレッドOで3時間10分インキュベートを室温で染色するためのプロピレングリコール中で平衡化5分、のために水で2回スライドを洗浄する。その後、プロピレングリコール及びPBSで30分で5分間サンプルを2回洗浄する。 30％グリセロールでマウントします。
6。代表的な結果：
図Figure 1に。 Parrafin組み込みのセクション
間接飛翔筋のヘマトキシリンとエオシンで染色横（AB）と縦（CD）のセクション。とCは通常の構造化された筋肉を示しています。サイズと形態の筋肉の異常は、それぞれBとD（黒矢印）で表されます。 （EF）核染色法抗LamC、核膜のマーカーとDAPI、 ショウジョウバエの胸部のステンドグラスの横断面。正常の拡大図（赤矢印）と劣化（黄矢印）筋肉（F）。 GはLamCとDAPIで染色したショウジョウバエ腸管のセクションを表します。
図2。凍結切片
オイルレッドO、脂質滴のラベルで染色されたショウジョウバエの胸部のA.横断凍結切片。
間接飛翔筋のB.縦凍結切片は、抗- DG、筋肉筋鞘マーカーとDAPIで染色した。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、私たちはクライオミクロトームを使用できるようにするため教授Eicheleに感謝。作業は、マックスプランクGesselschaftによって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel collars | Home made | Specially constructed | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Aluminum foil | Any Supplier | ||
| Blade or scalpel | Any Supplier | ||
| Wheaton macro staining jar | Wheaton | 900200 | |
| Microtome | Carl Zeiss, Inc. | Model: Hyrax M25 | |
| Cryo-microtome | Leica Microsystems | Model CM3050S | |
| 60-65°C Incubator | Any Supplier | Large enough to hold at least 4 staining jars | |
| Freezing cooler with metal block | Any Supplier | Store at -80°C | |
| Super-frost slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9161155 | |
| Cover slips | Any Supplier | Recommend 24 X 40 mm | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Analytical grade |
| Glacial acetic acid | Merck & Co., Inc. | 100063 | Analytical grade |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 100983 | Analytical grade |
| Methylbenzoate | Sigma-Aldrich | M29908-500G | Analytical grade |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | 76258 | Paraffin |
| Tissue-Teck O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 16% formaldehyde, methanol free | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150-1L |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).
- Shcherbata, H. R. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy. The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).
- Kucherenko, M. M. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex. PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. Carnoy fixation: practical and theoretical considerations. Histochemie. 16, 361-36 (1968).
- Ashburner, M. Drosophila - A Laboratory Manual. , CSHL Press. (1989).
- Sieber, M. H., Thummel, C. S. The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila. Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).
