Summary
Identificazione dei meccanismi alla base danno muscolare è cruciale. Qui vi presentiamo la tecnica istologica per la preparazione inclusi in paraffina e congelati sezioni dei muscoli toracici Drosophila. Questo permette l'analisi della morfologia muscolare e la localizzazione di proteine e altri componenti delle cellule muscolari.
Abstract
La caratterizzazione molecolare delle distrofie muscolari e miopatie nell'uomo non hanno rivelato la complessità della malattia muscolare e l'analisi genetica di specifica dei muscoli, la formazione e la funzione in sistemi modello ha fornito informazioni preziose in fisiologia muscolare. Pertanto, l'individuazione e la caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base danno muscolare è critica. La struttura di adulti Drosophila multi-fibra muscolare assomigliano vertebrati muscoli striati 1 e la trattabilità genetica della Drosophila ha fatto un grande sistema per analizzare la morfologia distrofica muscolare e caratterizzano i processi che interessano la funzione muscolare in età adulta vola 2. Qui vi presentiamo la tecnica istologica per la preparazione inclusi in paraffina e congelati sezioni dei muscoli toracici Drosophila. Queste preparazioni consentono di tessuto da macchie colorate con classica istologici ed etichettato con coloranti proteine rilevazione, e in particolare criosezioni sono ideali per la rilevazione immunoistochimica di proteine nei muscoli intatti. Questo permette di analisi della struttura del tessuto muscolare, l'identificazione di difetti morfologici e la rilevazione dei pattern di espressione per il muscolo / neuroni specifici per le proteine nei muscoli adulti Drosophila. Queste tecniche possono anche essere leggermente modificato per il sezionamento di altre parti del corpo.
Protocol
1. Preparazione
- Appena preparare fissativo Carnoy combinando etanolo assoluto, cloroformio ed acido acetico glaciale in proporzione 6:03:01 rispettivamente. 3 Questo, così come tutte le soluzioni per colletti sommergendo deve essere conservato in barattoli di vetro colorazione (vedi sezione reagenti per la raccomandazione).
- Preparare un foglio di alluminio tasche il formato corretto per i collari.
- Preparare le seguenti soluzioni in colorazione barattoli: 2 X 40% etanolo, 70% di etanolo, 2 X 100% etanolo, methylbenzoate (MB), 50/50 v / v MB e paraffina, 2 X paraffina. Posizionare il MB e contenitori di paraffina in un insieme incubatore a 60-65 ° C.
- Paraffina calda versare nelle tasche di pellicola a 60-65 ° C.
2. Fissaggio mosche in Collari
- Fissare i 4 collare sotto il binoculare con del nastro in una posizione verticale su cui si può vedere il punto di ingresso per la mosca.
- Anestetizzare vola con anidride carbonica o tramite ipotermia utilizzando un blocco di ghiaccio. Fare attenzione a non congelare le mosche.
- Utilizzando pinze, pick up vola singoli afferrando le ali e il luogo nel colletto orientata correttamente (testa e torace in cima delle pale e l'addome sotto le lame). 10-20 vola dovrebbe facilmente adattarsi al collo.
Nota: Se si sta analizzando genotipi diversi, non dimenticate di prendere nota del numero colletto e genotipo corrispondente.
3. Sezioni di paraffina toraci Drosophila
- Spostare il collare per la soluzione di Carnoy e fissare il tessuto a 4 ° C durante la notte.
- Dopo la fissazione, disidratano l'esempio utilizzando concentrazioni crescenti di etanolo. Per 10 minuti ogni immergere il collare in 40% (2 volte), 70% e 100% (2 volte) etanolo a temperatura ambiente. Collare incubare prossimo in MB e MB di paraffina soluzione + (1:1) per 30 minuti in ciascuna e quindi infiltrarsi il collare in due cambi di paraffina per 60 minuti ciascuno a 60-65 ° C. Spostare rapidamente il collare nella tasca foglio e riempire con il fuso (60-65 ° C) paraffina. Metterlo a temperatura ambiente e permettono la paraffina per diventare difficile (si consiglia di lasciare per una notte). Si noti che il collare può essere messo in tasca foglio in diversi orientamenti, a seconda dell'orientamento delle sezioni che vi servono (longitudinale o trasversale).
- Separa i blocchi di paraffina a secco con collari dal foglio separato e delicatamente il collare dal blocco di paraffina. Con l'aiuto di una lama affilata o bisturi tagliare con precisione l'olio extra-paraffina provenienti da tutto il tessuto volare.
- Tagliare il blocco di paraffina con passaggi 7-10 micron sezione su un microtomo rotazione e permettere il tessuto tagliato a galleggiare appartamento in un bagno d'acqua a 37 ° C. Posizionare il tessuto sezionato su vetrini polari e l'essiccazione durante la notte. Queste diapositive possono essere utilizzate per la colorazione con hematoxyline e eosina (Figura 1A-D), blu di toluidina, blu di anilina o altro muore per visualizzare le strutture dei tessuti, così come per la colorazione anticorpale (Figura 1E-E ``).
4. Criosezioni di toraci Drosophila
- Come nel caso di sezioni di paraffina, preparare le mosche in un collare e della moda una tasca un foglio di alluminio. Un dispositivo di raffreddamento congelamento saranno necessari per la preparazione dei campioni. Assicurarsi che il dispositivo di raffreddamento è di circa -60 ° C, usare un po 'di etanolo e ghiaccio secco per consentire il raggiungimento di tale temperatura. Un'ora prima di iniziare l'esperimento messo la bottiglia di crio-embedding media (Tissue-Tek composto ottobre) a testa in giù in un 4 ° C in frigo per raffreddarlo e ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria.
- Riposizionare il collare con le mosche per la tasca foglio che è stato pre-raffreddata per diversi minuti all'interno del refrigeratore congelamento e rapidamente riempire con la crio-embedding composto. Lasciate che il congelamento del campione per 3-10 min. Scartare con cura il blocco costituito all'interno del radiatore, separare delicatamente il collare dal blocco embedding e metterlo a -20 ° C per almeno un giorno.
- Tagliare i muscoli congelati su un crio-microtomo tra -15 e -18 ° C con uno spessore di sezione di 10-15 micron. Posto su vetrini polarizzati e conservare a -20 ° C fino al momento di fare ulteriori elaborazioni. Ti suggeriamo di fissaggio del tessuto in una soluzione di formaldeide al 4% PBS per 10 minuti a temperatura ambiente prima della colorazione degli anticorpi.
5. Rilevamento lipidi nei muscoli Drosophila
Gocce lipidiche possono essere rilevati con l'olio rosso O macchia criosezioni utilizzando un protocollo adottato da Sieber e Thummel 5.
- Dopo la fissazione, lavare i vetrini con acqua due volte per 5 min, equilibrati in glicole propilenico per 10 minuti e incubare per 3 ore in olio rosso O macchia a temperatura ambiente. Quindi lavare i campioni per 2 volte per 5 min in glicole propilenico e 30 minuti in PBS. Monte nel 30% glicerolo.
6. Rappresentante dei risultati:
FicoURE 1. Kerosene-embedded sezioni
Hematoxyline e eosina macchiato trasversale (AB) e longitudinale (CD) sezioni di muscoli volo indiretto. A e C mostra i muscoli normale strutturato. Anormale dai muscoli dimensioni e morfologia sono rappresentati in B e D, rispettivamente (frecce nere). Sezione trasversale del torace macchiato Drosophila con anti-LAMC, marcatore involucro nucleare e DAPI, nucleare macchia (EF). Visualizzazione ingrandita della normale (freccia rossa) e peggiorata (freccia gialla) muscoli (F). G rappresenta la sezione di Drosophila macchiato tratto intestinale con LAMC e DAPI.
Figura 2. Le sezioni congelate
A. Sezioni trasversali congelati torace macchiato di Drosophila con l'olio rosso O, etichetta di goccioline lipidiche.
B. sezioni longitudinali congelati dei muscoli volo indiretto colorati con anti-Dg, il muscolo sarcolemma marcatore e DAPI.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il Prof. Eichele per averci permesso di usare il crio-microtomo. Il lavoro è stato finanziato dal Max-Planck-Gesselschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel collars | Home made | Specially constructed | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Aluminum foil | Any Supplier | ||
| Blade or scalpel | Any Supplier | ||
| Wheaton macro staining jar | Wheaton | 900200 | |
| Microtome | Carl Zeiss, Inc. | Model: Hyrax M25 | |
| Cryo-microtome | Leica Microsystems | Model CM3050S | |
| 60-65°C Incubator | Any Supplier | Large enough to hold at least 4 staining jars | |
| Freezing cooler with metal block | Any Supplier | Store at -80°C | |
| Super-frost slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9161155 | |
| Cover slips | Any Supplier | Recommend 24 X 40 mm | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Analytical grade |
| Glacial acetic acid | Merck & Co., Inc. | 100063 | Analytical grade |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 100983 | Analytical grade |
| Methylbenzoate | Sigma-Aldrich | M29908-500G | Analytical grade |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | 76258 | Paraffin |
| Tissue-Teck O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 16% formaldehyde, methanol free | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150-1L |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).
- Shcherbata, H. R. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy. The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).
- Kucherenko, M. M. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex. PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. Carnoy fixation: practical and theoretical considerations. Histochemie. 16, 361-36 (1968).
- Ashburner, M. Drosophila - A Laboratory Manual. , CSHL Press. (1989).
- Sieber, M. H., Thummel, C. S. The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila. Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).
