Summary
मांसपेशियों की क्षति अंतर्निहित तंत्र की पहचान महत्वपूर्ण है. यहाँ हम आयल एम्बेडेड और ड्रोसोफिला वक्ष मांसपेशियों के वर्गों जमे हुए तैयार करने के लिए histological तकनीक मौजूद है. यह मांसपेशियों की आकारिकी और प्रोटीन और अन्य मांसपेशी कोशिका घटकों के स्थानीयकरण के विश्लेषण की अनुमति देता है.
Abstract
मानव में पेशी अपविकास और myopathies के आणविक लक्षण वर्णन मांसपेशियों की बीमारी की जटिलता और मांसपेशियों के विनिर्देशन के आनुवांशिक विश्लेषण से पता चला है, और मॉडल प्रणाली में गठन कार्य मांसपेशियों के शरीर क्रिया विज्ञान में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है. इसलिए, पहचान और आणविक तंत्र है कि मांसपेशियों की क्षति आबाद निस्र्पक के लिए महत्वपूर्ण है. वयस्क ड्रोसोफिला बहु फाइबर मांसपेशियों की संरचना समान है हड्डीवाला धारीदार 1 मांसपेशियों और ड्रोसोफिला के आनुवंशिक tractability यह एक महान प्रणाली dystrophic मांसपेशियों आकारिकी का विश्लेषण और बुढ़ापे वयस्क में पेशी समारोह को प्रभावित प्रक्रियाओं 2 मक्खियों विशेषताएँ बना दिया है. यहाँ हम आयल एम्बेडेड और ड्रोसोफिला वक्ष मांसपेशियों के वर्गों जमे हुए तैयार करने के लिए histological तकनीक मौजूद है . ये तैयारियाँ शास्त्रीय histological धब्बे के साथ सना हुआ हो सकता है और प्रोटीन का पता लगाने के रंगों के साथ लेबल ऊतक के लिए अनुमति देते हैं, और विशेष रूप से cryosections बरकरार मांसपेशियों में प्रोटीन की immunohistochemical पता लगाने के लिए आदर्श होते हैं. यह मांसपेशियों के ऊतकों की संरचना, morphological दोष की पहचान है, और मांसपेशियों / ड्रोसोफिला वयस्क मांसपेशियों में न्यूरॉन विशिष्ट प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाने के के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. इन तकनीकों में भी थोड़ा शरीर के अन्य भागों के सेक्शनिंग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Protocol
1. तैयार
- हौसले Carnoy लगानेवाला 06:03:01 अनुपात में क्रमशः निरपेक्ष इथेनॉल, क्लोरोफॉर्म और हिमनदों एसिटिक एसिड के संयोजन द्वारा तैयार 3. यह, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से submerging कॉलर के लिए सभी समाधान कांच धुंधला जार में रखा जाना चाहिए (सिफारिश के लिए अभिकर्मकों अनुभाग देखें).
- तैयार एल्यूमीनियम पन्नी कॉलर के लिए सही आकार को पाकेट के अंदर डालता है.
- 2 X 40% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, 2 एक्स 100% इथेनॉल, methylbenzoate (एमबी), 50/50 v / v एमबी और आयल, 2 एक्स आयल धुंधला: जार में निम्नलिखित समाधान तैयार करें. 60-65 सी. सेंटीग्रेड और एक मशीन सेट में एमबी आयल कंटेनरों प्लेस
- गर्म आयल पन्नी जेब में 60-65 डिग्री सेल्सियस के लिए डालना
2. कॉलर में मक्खियों फिक्सिंग
- जहाँ आप मक्खी के लिए प्रविष्टि बिंदु देख सकते हैं एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में टेप का उपयोग द्विनेत्री के तहत कॉलर 4 संलग्न .
- Anesthetize कार्बन या हाइपोथर्मिया के माध्यम से डाइऑक्साइड एक बर्फ ब्लॉक का उपयोग कर का उपयोग मक्खियों. मक्खियों को स्थिर नहीं सावधान रहो.
- संदंश का प्रयोग, ठीक उन्मुख कॉलर (और ब्लेड और ब्लेड नीचे पेट के शीर्ष पर सिर और छाती) में अपने पंख और जगह हथियाने के द्वारा अलग - अलग मक्खियों लेने. 10-20 मक्खियों कॉलर में आसानी से फिट होना चाहिए.
नोट: यदि आप कई जीनोटाइप का विश्लेषण कर रहे हैं, कॉलर संख्या और इसी जीनोटाइप के एक नोट बनाने के लिए मत भूलना.
3. ड्रोसोफिला Thoraxes के आयल धारा
- Carnoy समाधान के लिए स्थानांतरित करना कॉलर और 4 में ऊतकों को ठीक ° सी रात खत्म.
- निर्धारण के बाद, इथेनॉल की बढ़ती सांद्रता का उपयोग नमूना निर्जलीकरण. 10 मिनट 40 (2 बार)%, 70% और 100% (2 बार) कमरे के तापमान पर इथेनॉल में प्रत्येक डूब कॉलर के लिए. MB और एमबी + आयल समाधान (1:1) में प्रत्येक में 30 मिनट के लिए अगले सेते कॉलर और फिर 60 मिनट प्रत्येक के लिए दो आयल की 60-65 में परिवर्तन ° सी. में कॉलर घुसपैठ पन्नी जेब में तेजी से स्थानांतरित कॉलर और पिघला (60-65 डिग्री सेल्सियस) आयल के साथ भरें. यह कमरे के तापमान पर प्लेस और आयल मुश्किल बनने के लिए (यह सबसे अच्छा है रात भर छोड़ है) की अनुमति है. ध्यान दें कि कॉलर अलग झुकाव में पन्नी जेब में रखा जा सकता है वर्गों आप की जरूरत है (अनुदैर्ध्य या अनुप्रस्थ) के उन्मुखीकरण के आधार पर.
- पन्नी से कॉलर के साथ सूखी आयल ब्लॉक खोलना और धीरे आयल ब्लॉक से कॉलर अलग. एक तेज ब्लेड या स्केलपेल की मदद के साथ सावधानी से मक्खी ऊतक आसपास से अतिरिक्त आयल में कटौती.
- 7-10 सुक्ष्ममापी अनुभाग कदम के साथ एक रोटेशन सूक्ष्म तक्षणी पर आयल ब्लॉक कट और कटौती ऊतक एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में फ्लैट फ्लोट करने की अनुमति. ध्रुवीय स्लाइड पर sectioned ऊतक प्लेस और रात खत्म सुखाने की अनुमति. ये स्लाइड hematoxyline और eosin के साथ धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 1A-D) toluidine नीले, एनिलिन नीले या अन्य मर जाता है ऊतक संरचनाओं कल्पना करने के लिए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में एंटीबॉडी धुंधला के लिए (चित्रा 1E-ई ``).
4. ड्रोसोफिला Thoraxes के Cryosections
- आयल वर्गों के साथ के रूप में, एक कॉलर और फैशन एक एल्यूमीनियम पन्नी जेब में मक्खियों को तैयार है. एक ठंड कूलर के लिए नमूने तैयार करने के लिए की जरूरत होगी. सुनिश्चित करें कि कूलर -60 के आसपास है डिग्री सेल्सियस, इस तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए एक छोटे से इथेनॉल और सूखी बर्फ का उपयोग करें. प्रयोग शुरू करने से पहले एक घंटे क्रायो - एम्बेडिंग माध्यम की बोतल (ऊतक टेक अक्टूबर यौगिक) उल्टा क्रम में इसे शांत करने के लिए और हवा के बुलबुले के गठन को कम करने के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में डाल दिया.
- पन्नी जेब किया गया है कि पूर्व ठंड कूलर के अंदर कई मिनट के लिए ठंडा और तेजी यौगिक क्रायो - एम्बेडिंग के साथ भरने के लिए मक्खियों के साथ कॉलर स्थानांतरित करना. 3-10 मिनट के लिए नमूना फ्रीज चलो. ध्यान कूलर के अंदर गठित ब्लॉक खोलना, धीरे एम्बेडिंग ब्लॉक से कॉलर अलग और -20 डिग्री सेल्सियस पर यह कम से कम एक दिन के लिए डाल दिया.
- 10-15 सुक्ष्ममापी की एक अनुभाग मोटाई के साथ -15 और -18 डिग्री सेल्सियस के बीच क्रायो - सूक्ष्म तक्षणी पर जमी मांसपेशियों कट. Polarized स्लाइड पर प्लेस और जब तक आगे की प्रक्रिया करने के लिए तैयार -20 डिग्री सेल्सियस पर रखने. हम 4% formaldehyde पीबीएस समाधान में एंटीबॉडी धुंधला करने से पहले कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ऊतक फिक्सिंग सुझाव देते हैं.
5. लिपिड जांच में ड्रोसोफिला स्नायु
लिपिड बूंदों तेल लाल हे Sieber और Thummel 5 से अपनाया प्रोटोकॉल का उपयोग करने cryosections पर दाग के साथ पता लगाया जा सकता है.
- निर्धारण के बाद, पानी के साथ स्लाइड्स दो बार धोने के 5 मिनट, 10 मिनट के लिए 3 घंटे में तेल लाल हे कमरे के तापमान पर दाग सेते के लिए propylene glycol में equilibrated के लिए. तो नमूने propylene glycol और पीबीएस में 30 मिनट में 5 मिनट के लिए 2 बार धो लो. 30% ग्लिसरॉल में माउंट.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
अंजीर1 ure. Parrafin - एम्बेडेड वर्गों
Hematoxyline और eosine दाग अनुप्रस्थ (एबी) अनुदैर्ध्य और अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों के वर्गों (सीडी). ए और सी सामान्य संरचित मांसपेशियों से पता चलता है. आकार और आकारिकी की मांसपेशियों द्वारा असामान्य बी और डी क्रमशः (काला तीर) पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. विरोधी LamC परमाणु लिफाफा मार्कर और DAPI, दाग परमाणु (एफई) के साथ ड्रोसोफिला छाती दाग की अनुप्रस्थ अनुभाग . सामान्य के बढ़े हुए दृश्य (लाल तीर) और बिगड़ी मांसपेशियों (पीले तीर) (एफ). जी ड्रोसोफिला आंत्र पथ दाग के LamC और DAPI के साथ अनुभाग का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 2. जमे हुए वर्गों
ए ड्रोसोफिला तेल लाल हे, लिपिड बूंदों लेबल के साथ दाग छाती के ट्रांसवर्स जमी वर्गों .
बी अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों के अनुदैर्ध्य जमे हुए वर्गों के साथ दाग विरोधी महानिदेशक, मांसपेशी sarcolemma मार्कर और DAPI.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम हमें क्रायो - सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रो Eichele धन्यवाद. मैक्स प्लैंक - Gesselschaft कार्य द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel collars | Home made | Specially constructed | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Aluminum foil | Any Supplier | ||
| Blade or scalpel | Any Supplier | ||
| Wheaton macro staining jar | Wheaton | 900200 | |
| Microtome | Carl Zeiss, Inc. | Model: Hyrax M25 | |
| Cryo-microtome | Leica Microsystems | Model CM3050S | |
| 60-65°C Incubator | Any Supplier | Large enough to hold at least 4 staining jars | |
| Freezing cooler with metal block | Any Supplier | Store at -80°C | |
| Super-frost slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9161155 | |
| Cover slips | Any Supplier | Recommend 24 X 40 mm | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Analytical grade |
| Glacial acetic acid | Merck & Co., Inc. | 100063 | Analytical grade |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 100983 | Analytical grade |
| Methylbenzoate | Sigma-Aldrich | M29908-500G | Analytical grade |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | 76258 | Paraffin |
| Tissue-Teck O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 16% formaldehyde, methanol free | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150-1L |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).
- Shcherbata, H. R. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy. The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).
- Kucherenko, M. M. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex. PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. Carnoy fixation: practical and theoretical considerations. Histochemie. 16, 361-36 (1968).
- Ashburner, M. Drosophila - A Laboratory Manual. , CSHL Press. (1989).
- Sieber, M. H., Thummel, C. S. The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila. Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).
