Summary
Определение механизмов, лежащих повреждение мышц имеет решающее значение. Здесь мы представляем гистологической техники для подготовки парафин и замороженных участков Drosophila грудной мышцы. Это позволяет анализировать морфологию мышц и локализация белка и других компонентов клетки мышц.
Abstract
Молекулярная характеристика мышечной дистрофии и миопатии у людей выявил сложность заболевания мышц и генетический анализ мышечной спецификации, формирование и функции в модельных системах предоставил ценную информацию в мышечную физиологию. Таким образом, выявление и характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе повреждения мышц имеет решающее значение. Структура взрослых дрозофил мульти-волокна мышц напоминают позвоночных поперечно-полосатых мышц 1 и генетических уступчивость дрозофилы сделала большой системы для анализа морфологии дистрофические мышц и охарактеризовать процессы, затрагивающие мышечной функции в процессе старения взрослых мух 2. Здесь мы представляем гистологической техники для подготовки парафин и замороженных участков Drosophila грудной мышцы. Эти препараты позволяют ткани, которая будет окрашивали классических гистологических пятен и помечены с белком обнаружения красителей, и, в частности cryosections идеально подходят для иммуногистохимического выявления белка в интактных мышцах. Это позволяет для анализа структуры мышечной ткани, определение морфологических дефектов, и обнаружение экспрессии для мышечной / нейрон-специфических белков в мышцах дрозофилы взрослых. Эти методы также могут быть слегка модифицирован для секционирования других частей тела.
Protocol
1. Подготовка
- Недавно подготовить фиксатором Карнуа путем объединения абсолютного этанола, хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношении 6:03:01 соответственно. 3 Это, а также все решения для погружения воротники следует хранить в стеклянных банках окрашивания (см. раздел реагентов для рекомендации).
- Подготовка алюминиевой фольги карманы правильный размер для воротников.
- Подготовьте следующие решения в окрашивании банки: 2 х 40% этанол, 70% этанола, 2 х 100% этанол, метилбензоата (МБ), 50/50 об. / МБ и парафина, 2 х парафин. Место МБ и парафина контейнеров в термостат до 60-65 ° С.
- Теплый парафин вылить в фольгу карманы до 60-65 ° С.
2. Крепление Летает в воротничков
- Прикрепите воротник 4 под бинокулярным с помощью липкой ленты в вертикальном положении, где можно увидеть точки входа для летать.
- Обезболить мухи использованием углекислого газа или с помощью гипотермии использованием ледяная глыба. Будьте осторожны, чтобы не заморозить мух.
- Использование щипцов, подобрать индивидуальный мухи, захватывая их крыльев и поместить в воротник ориентированных правильно (головы и грудной клетки в верхней части лезвия и живота ниже лезвия). 10-20 мухи должны легко вписываться в воротник.
Примечание: Если вы анализируете несколько генотипов, не забудьте сделать сведению воротник номер и соответствующий генотип.
3. Парафин Разделы дрозофилы Thoraxes
- Перемещение воротник к решению Карнуа и зафиксировать ткань при температуре 4 ° С в течение ночи.
- После фиксации обезвоживают образца с помощью увеличения концентрации этанола. За 10 минут погрузиться воротник на 40% (2 раза), 70% и 100% (2 раза) этанола при комнатной температуре. Следующая воротник инкубировать в МБ и МБ + парафин решение (1:1) в течение 30 минут в каждой, а затем проникнуть воротник в две смены парафина в течение 60 минут каждый на 60-65 ° C. Быстро переместить воротник в фольгу карман и заполнить с топленым (60-65 ° С) парафин. Поместите его при комнатной температуре и позволяют парафином, чтобы стать жесткой (лучше всего оставить на ночь). Обратите внимание, что воротник можно поместить в карман в фольгу различной ориентации, в зависимости от ориентации разделы вам нужно (продольные или поперечные).
- Берем сухой блоков парафина с воротниками из фольги и аккуратно отделить воротником из парафинового блока. С помощью острого лезвия или скальпеля аккуратно вырезать экстра-парафин со всего летать ткани.
- Вырезать парафиновый блок с 7-10 мкм разделе шаги на вращение микротома и позволяют сократить ткани плавать квартиру в 37 ° С водяной бане. Место секционного ткани на полярных слайды и дать высохнуть в течение ночи. Эти слайды можно использовать для окрашивания hematoxyline и эозином (рис. 1А-D), толуидиновым синим, анилин синий или другой умирает для визуализации тканевых структур, а также для окрашивания антител (рис. 1E-E ``).
4. Cryosections дрозофилы Thoraxes
- Как и парафиновых срезов, подготовке летит в ворота и моды кармана алюминиевую фольгу. Замораживания кулер будет, необходимых для подготовки образцов. Убедитесь, что кулер составляет около -60 ° C, используйте немного этанола и сухой лед, чтобы для достижения этой температуры. Час, прежде чем начать эксперимент положил бутылку крио-вложение среды (ткани-Tek октября соединения) вниз головой в 4 ° C холодильник, чтобы охладить его и свести к минимуму образование воздушных пузырьков.
- Перемещение воротник с летит в фольге карман, который был предварительно охладить в течение нескольких минут внутри замерзания охладителя и быстро заполнять крио-вложение соединения. Пусть образец заморозить в течение 3-10 мин. Аккуратно развернуть формируется блок внутри кулера, мягко отдельный воротник из вложения блок и поместить его при температуре -20 ° С в течение не менее одного дня.
- Вырезать замороженных мышц на крио-микротома от -15 до -18 ° C с раздела толщиной 10-15 мкм. Место на поляризованных слайдов и сохранить при температуре -20 ° С до готовности делать дальнейшую обработку. Мы предлагаем крепления ткани в 4%-ный раствор формальдегида PBS в течение 10 мин при комнатной температуре до антитела окрашивания.
5. Липиды обнаружения в мышцах дрозофилы
Липидные капли могут быть обнаружены с маслом красной O пятно на cryosections использованием протокола, принятого от Зибер и Thummel 5.
- После фиксации, мыть слайды с водой два раза в течение 5 мин, уравновешенную пропиленгликоля в течение 10 мин и инкубировать в течение 3 ч в масле красного пятна O при комнатной температуре. Затем промыть образцы 2 раза по 5 мин в пропиленгликоля и 30 мин в PBS. Горы в 30% глицерина.
6. Представитель Результаты:
Инжиррисунке 1. Парафиновыми-срезы
Hematoxyline и эозином окрашенных поперечных (АВ) и продольного (CD) разделы косвенные мышцы полета. А и С показывает нормальную структурированную мышц. Аномальные по размеру и морфологии мышц представлены на B и D соответственно (черные стрелки). Поперечный разрез окрашенных грудной клетки дрозофилы с анти-LAMC, ядерной маркер конверт и DAPI, ядерной пятна (EF). Увеличенное изображение нормального (красная стрелка) и ухудшилось (желтая стрелка), мышц (F). G представляет раздел дрозофилы кишечного тракта с окрашенных LAMC и DAPI.
Рисунок 2. Замороженные срезы
А. Поперечные закрепленные участки дрозофилы грудной клетки окрашиваются красным маслом O, этикетка липидные капли.
Б. Продольное замороженных срезах косвенных летательные мышцы окрашиваются анти-Dg, мышечные сарколеммой маркер и DAPI.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Eichele за предоставленную нам возможность использовать крио-микротоме. Работа была профинансирована Max-Planck-Gesselschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel collars | Home made | Specially constructed | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Aluminum foil | Any Supplier | ||
| Blade or scalpel | Any Supplier | ||
| Wheaton macro staining jar | Wheaton | 900200 | |
| Microtome | Carl Zeiss, Inc. | Model: Hyrax M25 | |
| Cryo-microtome | Leica Microsystems | Model CM3050S | |
| 60-65°C Incubator | Any Supplier | Large enough to hold at least 4 staining jars | |
| Freezing cooler with metal block | Any Supplier | Store at -80°C | |
| Super-frost slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9161155 | |
| Cover slips | Any Supplier | Recommend 24 X 40 mm | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Analytical grade |
| Glacial acetic acid | Merck & Co., Inc. | 100063 | Analytical grade |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 100983 | Analytical grade |
| Methylbenzoate | Sigma-Aldrich | M29908-500G | Analytical grade |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | 76258 | Paraffin |
| Tissue-Teck O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 16% formaldehyde, methanol free | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150-1L |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).
- Shcherbata, H. R. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy. The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).
- Kucherenko, M. M. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex. PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. Carnoy fixation: practical and theoretical considerations. Histochemie. 16, 361-36 (1968).
- Ashburner, M. Drosophila - A Laboratory Manual. , CSHL Press. (1989).
- Sieber, M. H., Thummel, C. S. The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila. Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).
