Summary
Identificación de los mecanismos que subyacen a daño muscular es crucial. Aquí se presenta la técnica histológica para la preparación de parafina y las secciones congeladas de los músculos torácicos Drosophila. Esto permite el análisis de la morfología del músculo y la localización de las proteínas y otros componentes de la célula muscular.
Abstract
La caracterización molecular de las distrofias musculares y miopatías en los seres humanos ha puesto de manifiesto la complejidad de la enfermedad del músculo y el análisis genético de la especificación de los músculos, la formación y funciones de los sistemas modelo ha proporcionado información valiosa sobre la fisiología del músculo. Por lo tanto, identificar y caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen en el daño muscular es fundamental. La estructura de los adultos Drosophila multi-fibra de los músculos de los vertebrados se parecen a los músculos estriados 1 y la trazabilidad genética de la Drosophila ha hecho un gran sistema para analizar la morfología del músculo distrófico y caracterizar los procesos que afectan la función muscular en el adulto mayor moscas 2. Aquí se presenta la técnica histológica para la preparación de parafina y las secciones congeladas de los músculos torácicos Drosophila. Estas preparaciones permiten que el tejido se puede teñir con tinciones histológicas clásicas y etiquetados con tintes detectar proteínas, y en concreto cryosections son ideales para la detección inmunohistoquímica de las proteínas en los músculos intactos. Esto permite el análisis de la estructura del tejido muscular, la identificación de defectos morfológicos, y la detección del patrón de expresión de los músculos / las neuronas específicas de las proteínas en los músculos de los adultos de Drosophila. Estas técnicas también pueden ser ligeramente modificados para el corte de otras partes del cuerpo.
Protocol
1. Preparación
- Recién preparar el fijador de Carnoy mediante la combinación de etanol absoluto, cloroformo y ácido acético glacial en proporción 06:03:01 respectivamente. 3 Este, así como todas las soluciones para cuellos sumergiendo debe tenerse en cubetas de vidrio (véase la sección reactivos para la recomendación).
- Preparar bolsas de papel de aluminio del tamaño adecuado para los collares.
- Prepare las siguientes soluciones en frascos de tinción: 2 X 40% etanol, 70% de etanol, 2 X 100% de etanol, metilbenzoato (MB), 50/50 MB v / v, y la parafina, parafina X 2. Coloque el MB y contenedores de parafina en una incubadora a 60-65 º C.
- Parafina caliente para verter en los bolsillos de papel a 60-65 º C.
2. Moscas en la fijación de collares
- Conecte el 4 de cuello bajo el binocular con cinta adhesiva en una posición vertical en la que se puede ver el punto de partida para la marcha.
- Anestesiar a las moscas con el dióxido de carbono o por hipotermia con un bloque de hielo. Tenga cuidado de no congelar las moscas.
- Con unas pinzas, recoja las moscas individuales por el acaparamiento de las alas y el lugar en el cuello orientado correctamente (cabeza y tórax en la parte superior de las hojas y el abdomen por debajo de las hojas). 10-20 vuela con facilidad, deben encajar en el cuello.
Nota: Si usted está analizando varios genotipos, no se olvide de tomar nota del número de collar y el genotipo correspondiente.
3. Secciones de parafina de tórax Drosophila
- Vuelva a colocar el collar para la solución de Carnoy y reparar el tejido a 4 ° C durante la noche.
- Después de la fijación, deshidratación de la muestra con concentraciones crecientes de etanol. Durante 10 minutos cada uno sumergir el cuello en un 40% (2 veces), 70% y 100% (2 veces) de etanol a temperatura ambiente. Collar incuban en una solución de próxima MB y MB de parafina + (1:1) durante 30 minutos en cada uno y luego se infiltran en el cuello en dos cambios de parafina durante 60 minutos cada uno a 60-65 ° C. Rápidamente la ubicación de la collar en el bolsillo de aluminio y rellenar con queso (60-65 ° C) parafina. Lugar a temperatura ambiente y permitir que la parafina se endurezcan (lo mejor es dejar toda la noche). Tenga en cuenta que el collar se puede colocar en la bolsa de papel de aluminio en diferentes orientaciones, en función de la orientación de las secciones que necesite (longitudinal o transversal).
- Separar los bloques de parafina en seco con los collares de papel de aluminio y suavemente separar el cuello del bloque de parafina. Con la ayuda de un cuchillo afilado o un bisturí corte cuidadosamente la parafina extra de todo el tejido de volar.
- Cortar el bloque de parafina con 7.10 micras medidas sección en un microtomo de rotación y permitir que el tejido cortado a flotar en el plano a 37 ° C baño de agua. Coloque el tejido seccionado en láminas polar y dejar secar durante la noche. Estas diapositivas se puede utilizar para la tinción con hematoxilina y eosina (Figura 1-D), azul de toluidina, azul de anilina o muere otra para visualizar estructuras de tejido, así como para la tinción de anticuerpos (Figura 1-E ``).
4. Cryosections de tórax Drosophila
- Al igual que con los cortes de parafina, preparar las moscas en un cuello y una bolsa de moda papel de aluminio. Un enfriador de congelación será necesario para preparar las muestras. Asegúrese de que el refrigerador es de alrededor de -60 ° C, use un poco de etanol y hielo seco para permitir llegar a esta temperatura. Una hora antes de comenzar el experimento puso la botella de medio crio-incrustación (Tissue-Tek compuesto OCT) al revés en un 4 ° C en nevera para que se enfríe y para minimizar la formación de burbujas de aire.
- Vuelva a colocar el collar de moscas de la bolsa de papel de aluminio que ha sido pre-enfriado por varios minutos dentro del refrigerador de congelación rápida y rellenar con el compuesto de la crio-incrustación. Deje que la congelación de la muestra de 3-10 min. Separar cuidadosamente el bloque formado dentro de la nevera, con cuidado separar el cuello del bloque de inclusión y lo puso a -20 ° C durante al menos un día.
- Cortar los músculos congelados en un crio-micrótomo entre -15 y -18 ° C con un espesor de corte de 10-15 micras. Lugar en láminas polarizadas y mantener a -20 ° C hasta que esté listo para hacer su posterior procesamiento. Sugerimos la fijación del tejido en formaldehído al 4% de solución de PBS por 10 min a temperatura ambiente antes de la tinción de anticuerpos.
5. Detección de los lípidos en los músculos de Drosophila
Las gotas de lípidos se puede detectar con aceite rojo O mancha en cryosections utilizando un protocolo adoptado de Sieber y Thummel 5.
- Después de la fijación, lavar los portaobjetos con agua dos veces durante 5 minutos, equilibrada en propilenglicol durante 10 minutos y se incuba durante 3 horas en aceite rojo O tinción a temperatura ambiente. A continuación, lavar las muestras 2 veces por 5 min en propilenglicol y 30 minutos en PBS. Monte en el 30% de glicerol.
6. Los resultados representativos:
Higola Figura 1. Parafina embebido en secciones
Hematoxilina y eosina manchado transversal (AB) y longitudinal (CD) las secciones de los músculos de vuelo indirecto. A y C muestra normal de los músculos estructurado. Anormal de los músculos de tamaño y morfología están representados en B y D, respectivamente (flechas en negro). Sección transversal del tórax Drosophila teñida con anticuerpos anti-LAMC, marcador de membrana nuclear y la DAPI, tinción nuclear (EF). Vista ampliada de la normal (flecha roja) y el deterioro (flecha amarilla), los músculos (F). G representa la sección de teñido Drosophila tracto intestinal con LAMC y DAPI.
Figura 2. Las secciones congeladas
A. transversal congelada de las secciones teñidas tórax Drosophila con aceite rojo O, lípidos etiqueta gotas.
B. Longitudinal secciones congeladas de los músculos de vuelo indirecto teñidas con anti-DG, el músculo sarcolema marcador y DAPI.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos al Prof. Eichele de lo que nos permite utilizar la crio-microtomo. El trabajo fue financiado por el Max-Planck-gesselschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel collars | Home made | Specially constructed | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Aluminum foil | Any Supplier | ||
| Blade or scalpel | Any Supplier | ||
| Wheaton macro staining jar | Wheaton | 900200 | |
| Microtome | Carl Zeiss, Inc. | Model: Hyrax M25 | |
| Cryo-microtome | Leica Microsystems | Model CM3050S | |
| 60-65°C Incubator | Any Supplier | Large enough to hold at least 4 staining jars | |
| Freezing cooler with metal block | Any Supplier | Store at -80°C | |
| Super-frost slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9161155 | |
| Cover slips | Any Supplier | Recommend 24 X 40 mm | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Analytical grade |
| Glacial acetic acid | Merck & Co., Inc. | 100063 | Analytical grade |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 100983 | Analytical grade |
| Methylbenzoate | Sigma-Aldrich | M29908-500G | Analytical grade |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | 76258 | Paraffin |
| Tissue-Teck O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 16% formaldehyde, methanol free | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150-1L |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).
- Shcherbata, H. R. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy. The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).
- Kucherenko, M. M. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex. PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. Carnoy fixation: practical and theoretical considerations. Histochemie. 16, 361-36 (1968).
- Ashburner, M. Drosophila - A Laboratory Manual. , CSHL Press. (1989).
- Sieber, M. H., Thummel, C. S. The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila. Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).
