Summary
Este protocolo describe un procedimiento general para el estudio de unión al receptor recombinante de dominio (RBD) basado en vacunas de subunidades contra el SARS. Que incluye los métodos de transfección y expresión de la proteína en las células 293T RBD, la inmunización de ratones con RBD y la detección de la actividad de neutralización de los sueros de ratón utilizando un pseudovirus SRAS establecida una prueba de neutralización.
Abstract
En base a su perfil de seguridad y capacidad de inducir potentes respuestas inmunes contra las infecciones, las vacunas de subunidades se han utilizado como candidatos para una amplia variedad de patógenos 3.1. Dado que el sistema de células de mamíferos es capaz de modificaciones post-traduccionales, formando así proteínas correctamente plegadas y glicosilada, proteínas recombinantes expresadas en células de mamíferos han mostrado el mayor potencial de mantener alta antigenicidad y la inmunogenicidad de 4-6.
Aunque no hay nuevos casos de SARS se han reportado desde el año 2004, los brotes futuros son una amenaza constante, por lo tanto, el desarrollo de vacunas contra el SARS-CoV es un paso prudente y preventiva debe llevarse a cabo. La RBD de proteína SARS-CoV S juega un papel importante en la unión al receptor y la inducción de anticuerpos neutralizantes específicos contra la infección por el virus de 7-9. Por lo tanto, en este protocolo, se describen nuevos métodos para el desarrollo de una vacuna subunidad RBD basada contra el SARS. En pocas palabras, la proteína recombinante RBD (rRBD) se expresó en el sobrenadante del cultivo de células de mamíferos 293T para obtener una proteína correctamente plegada con la conformación adecuada y alta inmunogenicidad 6. La transfección del plásmido recombinante que codifica RBD a las células se realizó mediante un método de transfección de fosfato de calcio 6,10, con algunas modificaciones. En comparación con el método de transfección de lípidos 11,12, este fosfato de calcio modificados método de transfección es más barato, más fácil de manejar, y tiene el potencial para llegar a una alta eficacia una vez que un complejo de transfección con el tamaño y forma adecuados está formado 13,14. Por último, un ensayo de neutralización pseudovirus SRAS fue introducido en el protocolo y se utiliza para detectar la actividad neutralizante de los sueros de los ratones vacunados con la proteína rRBD. Este ensayo es relativamente seguro, no implica una enfermedad infecciosa SARS-CoV, y se puede realizar sin necesidad de un laboratorio de bioseguridad 3 15.
El protocolo descrito aquí también se puede utilizar para el diseño y estudio de las vacunas recombinantes contra la subunidad otros virus con las proteínas de fusión de clase I, por ejemplo, el VIH, el virus respiratorio sincitial (VRS), el virus del Ébola, el virus de la influenza, así como los virus Nipah y Handra. Además, los métodos para la generación de un pseudovirus y, posteriormente, el establecimiento de un ensayo de neutralización pseudovirus se puede aplicar a todos estos virus.
Protocol
1. Recombinante SARS-CoV RBD preparación de proteínas
- Prepare fosfato de calcio reactivo de transfección
- 2X preparación de buffer HBS: Mezcle 16 g de NaCl, 0,4 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, y 13.0 g de HEPES. Ajustar el pH a 7,00 y criar a un volumen total de 1.000 ml de agua destilada. Después de filtrar la solución para la esterilización, alícuota y almacenar a -20 ° C.
Sugerencia: Cualquier variación del valor de pH podría afectar los resultados de la transfección. Por lo tanto, es aconsejable probar varios valores de pH alrededor de 7,00 (por ejemplo, 6,99, 7,00 o 7,01) y encontrar el mejor para la transfección utilizando el método se presentan a continuación. - 2,5 M CaCl 2 Preparación: Añadir 73,5 g de CaCl 2 * 2H 2 O en agua destilada en un volumen final de 200 ml. Filtrar la solución y almacenar a -20 ° C.
- 2X preparación de buffer HBS: Mezcle 16 g de NaCl, 0,4 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, y 13.0 g de HEPES. Ajustar el pH a 7,00 y criar a un volumen total de 1.000 ml de agua destilada. Después de filtrar la solución para la esterilización, alícuota y almacenar a -20 ° C.
- Transfección del plásmido recombinante y purificación de proteínas
- Dividir las células 293T en 50-70% de confluencia de 24 horas antes de la transfección. Se cultivan las células en la T-175 cm 2 frascos de cultivo de tejidos de 40 ml de DMEM con 10% inactivado por calor (HI), FBS y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Todos los reactivos de transfección deben ser llevados a la temperatura ambiente antes de la transfección. Estos reactivos son 2X HBS, 2,5 M CaCl 2, DIH 2 O, y rRBD plásmido 6.
Sugerencia: El plásmido recombinante final de construcción utilizada para la expresión de la proteína debe contener un péptido señal para garantizar la secreción de proteínas recombinantes expresadas en el sobrenadante del cultivo. A 6x Su etiqueta se puede agregar a la C-terminal de la proteína expresada para la purificación fácil. - Prepare un 50 mL (A) y uno de 15 ml (B) BD tubo Falcon, y añadir los reactivos a los tubos como se indica en la Tabla 1. Añadir 2X tampón HBS para A. tubo en tubo B, añadir 2,5 M CaCl 2 y rRBD plásmido, y llevar el volumen a la exigencia en el DIH 2 O.
Tabla 1. Transfección preparación de la mezcla y los volúmenesA. Una T-175 cm 2 frasco de cultivo de tejidos (4000 l / frasco): prepararse para la expresión rRBD Un tubo Tubo B 2X EPF 2000 l 2,5 M de CaCl2 200 l ADN plásmido rRBD 40 g DIH 2 O a 2000 l B. Una de 100 mm de una caja de petri (1000 l / placa): prepararse para la producción pseudovirus SRAS Un tubo Tubo B 2X EPF 500 l 2,5 M de CaCl2 50 L ADN plásmido SARS-CoV S 5 mg VIH-1 plásmido (pNL4-3.luc.RE) 5 mg DIH 2 O a 500 l
Los volúmenes que figuran en el Cuadro 1 se para la unidad de la transfección uno. Si hay más botellas o platos se utilizan para la transfección, ajustar el volumen en consecuencia. - Añadir la solución de ADN-B del calcio en el tubo en el tubo de una manera gota a gota, mientras se mantiene constante y suave mezcla en un torbellino. Deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 min. La clave del éxito para la transfección de fosfato de calcio depende del tamaño y la forma del precipitado formado. Por lo tanto, la mezcla en un vórtex constantemente y poco a poco para cumplir con este requisito y, en consecuencia, mejorar la eficacia de transfección.
- Agregue la mezcla de una manera gota a gota, e incluso en las células 293T (4000 l / frasco). Las células de cultivo en la incubadora a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Vuelva a colocar el medio de cultivo con suero fresco libre de OPTI-MEM I reducido Serum Medium (50 ml / frasco) 80 a 10 h después de la transfección. Continuar con las células de cultivo para dos días más en las mismas condiciones.
- Recoger el líquido sobrenadante que contiene la proteína expresada rRBD 72 h después de la transfección. Centrifugar a 6000 rpm durante 15 minutos para eliminar los desechos celulares. Añadir un cóctel de inhibidores de proteasa para el sobrenadante se recogió y se almacenan a 4 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, purificar la proteína recombinante rRBD del sobrenadante del cultivo siguiendo las instrucciones del fabricante de Ni-NTA SuperFlow siguiente.
- Concentrado de proteína purificada usando Amicon Ultra tubos de concentración de -15. Después de la concentración de proteínas,añadir PBS a la concentración de los tubos y centrifugar de nuevo para eliminar imidazol en tampón de elución. Calcular la concentración de proteínas y almacenar la proteína purificada a -80 ° C hasta su uso.
2. La inmunización del ratón y Toma de Muestras
- Pre-caliente el sistema Sigma adyuvante (SAS) a 40-45 ° C de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir 1 ml de PBS por vial y mezclar bien.
- Prepare la proteína-adyuvante emulsión de acuerdo con el protocolo en la Tabla 2. Pipeta calcula rRBD proteína en un tubo de 1,5 ml. Añadir un volumen igual de adyuvante SAS en el tubo y agitar vigorosamente durante 2-3 minutos para formar la emulsión.
Sugerencia: Los volúmenes que figuran en el Cuadro 2 son para un ratón. Ajustar los volúmenes de acuerdo con los números del ratón real utilizado. Para cada grupo, mezclar las proteínas y adyuvante para cada vacuna. Siempre prepare una muestra adicional de la vacuna para asegurar la exactitud.
Tabla 2. Ratón protocolo de inmunizaciónGrupo 1 de la vacuna
(200 l / ratón)2 de la vacuna
(200 l / ratón)3 de la vacuna
(200 l / ratón)rRBD proteínas 20 mg de proteína en PBS
(100 l) + 100 l SAS10 g de proteína en PBS (100 l) + 100 l SAS 10 g de proteína en PBS (100 l) + 100 l SAS PBS de control 100 L de PBS +
100 L SAS100 L de PBS +
100 L SAS100 L de PBS +
100 L SAS - Por vía subcutánea estelar inmunizar a las mujeres ratones Balb / c (4-6 semanas de edad, 5 ratones / grupo), y aumentar dos veces con rRBD SAS y como se indica en la Tabla 2. Use grupo PBS como control. El sitio de las inyecciones subcutáneas generalmente elegido es la piel suelta entre los omoplatos. Por otra parte, la parte ventral del abdomen es de uso común, porque es más fácil de inyectar, y puede observar el líquido de la inyección. Cuando las dosis repetidas de las vacunas se utilizan, es fácil para seleccionar varios sitios de inyección, evitando posibles reacciones cutáneas locales.
- Sangrar ratones a través de retro-orbital con anestesia antes de la inmunización y 10 días después de cada vacunación, y el calor los sueros a 56 ° C durante 30 min para inactivar el complemento. Almacenar sueros de ratón a -20 ° C hasta su uso.
3. La neutralización de detección mediante ensayo de neutralización Pseudovirus
- Prepare pseudovirus SRAS
- Dividir las células 293T en 100 mm de cultivo de tejidos placas de Petri (2x10 6 células / placa) 16 h antes de la transfección, las células crecen y que el anterior.
- Preparar los reactivos de transfección, como se indica en la Tabla 1. Proteínas co-transfectar un plásmido que codifica el SARS-CoV S y un plásmido que codifica Env defectuoso, la luciferasa que expresan el VIH-1 del genoma (pNL4-3.luc.RE) con fosfato de calcio reactivo de transfección.
- Vuelva a colocar medio con 10 ml DMEM con 10% de SFB y 1% P / S 08.10 h post-transfección. Recoger el líquido sobrenadante pseudovirus para contener el SRAS 72 h después de la transfección.
- Pseudovirus filtro a través de un filtro de 0,45 micras. Alícuota y almacenar a -80 ° C hasta su uso.
- Pseudovirus SRAS ensayo de neutralización
- Dividir las células 293T expresando el SARS-CoV receptor ACE2 (ACE2/293T) a 10 4 células/100 l / pocillo en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos de 16 horas antes de la infección.
- Diluir pseudovirus SRAS por dos veces para detectar el título del virus en las células ACE2/293T.
- Serie diluir sueros de ratón en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos, y añadir un volumen igual de pseudovirus titulada SRAS. Preincubación de las placas a 37 ° C durante 1 h.
- Después de la incubación, añadir 100 ml de la mezcla de suero-pseudovirus a las células ACE2/293T, y continúan creciendo las células a 37 ° C en 5% de CO 2. Añadir DMEM 24 horas más tarde.
- Eliminar por completo la cultura sobrenadantes de las placas 72 horas después de la infección. Añadir 1X cultura luciferasa de células reactivo de lisis (60 l / pocillo), y promover la lisis celular con agitación constante de las placas durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
- Lisados de la transferencia de células (50 l / pocillo) en placas de luminómetro (Microfluor de 96 pocillos). Añadir el sustrato de luciferasa (50 l / pocillo) incluidos en el sistema de ensayo de luciferasa, y detectar la actividad luciferasa relativa en Ultra 384 luminómetro.
- Calcular pseudovirus SRAS título de neutralización y se presentan como título de anticuerpos neutralizantes del 50% (NT 50) 6.
Discussion
La densidad celular es un factor importante que afecta la eficacia de fosfato de calcio basado en la transfección. En nuestra experiencia, menos del 70% de confluencia de las células trae los mejores resultados. Por lo tanto, con el fin de mejorar la eficiencia de la transfección, se recomienda que la densidad celular se mantuvo en torno al 50-70% de confluencia. El fosfato de calcio método de transfección se piensa generalmente para ser menos eficiente en comparación con otros métodos de transfección, tales como la transfección de lípidos 16. Sin embargo, en este protocolo, el fosfato de calcio modificados método de transfección mediante el cual constante y lento la mezcla de la solución de transfección en un vórtice se asegura la formación de un precipitado con el tamaño y forma apropiada, mejorando así la eficiencia de transfección.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los Estados Unidos (RO1 AI68002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Na2HPO4*7H2O | Sigma-Aldrich | S2429 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| OPTI-MEM I Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836170001 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30450 | |
| Sigma adjuvant system | Sigma-Aldrich | S6322 | |
| Luciferase assay system | Promega Corp. | E1501 | |
| Luciferase cell culture lysis reagent (5X) | Promega Corp. | E1531 | |
| Amicon Ultra - 15 | EMD Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor 96-well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7905 | |
| Ultra 384 luminometer | Tecan Group Ltd. |
References
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