Summary
इस प्रोटोकॉल संस्कृति supernatants या शरीर के तरल पदार्थ में मैट्रिक्स metalloproteinases का पता लगाने के लिए एक गतिविधि आधारित परख का वर्णन करता है.
Protocol
1. लोड हो रहा है और जेल रनिंग
- सभी नमूनों पर्याप्त रूप से तैयार किया जाना चाहिए एंजाइमों के समारोह को बनाए रखने और संग्रह के बाद तुरंत इस्तेमाल किया या -80 में जमे हुए संग्रहीत डिग्री सेल्सियस नमूनों को कम करने एजेंट शामिल नहीं है (एक ऐसी β-mercaptoethanol) या जेल लोड करने से पहले उबला हुआ होना चाहिए.
- एक कैसेट के अंदर एक जेल से युक्त थैली खोलें, विआयनीकृत जल के साथ कैसेट कुल्ला.
- सुरक्षात्मक टेप कैसेट और जेल के ऊपर से कंघी के नीचे से निकालें.
- चल बफर (विआयनीकृत जल में 1X को पतला) के साथ कुओं तीन बार कुल्ला.
- मिनी सेल, सुनिश्चित करना है कि कैसेट के छोटे पक्ष भीतर चेहरे में जेल रखें. जेल तनाव कील के साथ जगह में बंद. मिनी सेल करने के लिए समानांतर में एक या दो जैल चलाने की अनुमति देता है.
- 1X कुओं स्तर से ऊपर चल रहा है बफर के साथ शीर्ष चैम्बर (अंदर) भरें, किसी भी लीक के लिए जाँच करें. लीक के मामले में, बफर हटाने और जेल reposition.
- निचले सदन 1X चल रहा है बफर के साथ भरें.
- एक अच्छी तरह से में प्रोटीन आणविक मार्कर के 10 μL लोड.
- जेल लोडिंग युक्तियाँ (प्रत्येक नमूने के बीच बदल) का उपयोग करते हुए जेल के कुओं में जेल लोडिंग के बफर और नमूना और लोड के एक बराबर राशि मिक्स. इन कुओं के साथ लोड किया जा सकता है 20 μL कुल.
- मिनी सेल पर ढक्कन प्लेस और बिजली की आपूर्ति करने के लिए इलेक्ट्रोड डोरियों कनेक्ट. पर बिजली की आपूर्ति स्विच और यह सेट 90 मिनट के लिए 125 लगातार वी पर चलाने के लिए. निचले सदन के तार पर छोटे बुलबुले के गठन की जाँच करें, वर्तमान संचलन का संकेत है.
- जब आपका पहला जेल चल रहे हैं, प्रवास हर 15 मिनट की प्रगति की निगरानी, bromophenol एक संकेतक के रूप में लोड बफर में शामिल नीले रंग का उपयोग. जेल रन चलो जब तक सूचक डाई जेल के नीचे तक पहुँचता है.
2. Renaturing और जेल का विकास
- प्रत्येक जेल के लिए, 1X renaturing बफर और बफर denaturing के 200 एमएल के 100 एमएल, विआयनीकृत जल दोनों में तैयार करते हैं.
- जब bromophenol नीले ट्रैकिंग डाई जेल के नीचे तक पहुँच, बिजली की आपूर्ति बंद, मिनी सेल खुला, और जेल को हटा दें. कैसेट के दो पक्षों ने जेल चाकू (या एक वजन रंग) का उपयोग कर अलग. जेल दिशा निशान कोने कट.
- ध्यान से कैसेट और एक कंटेनर में जगह से 100 एमएल renaturing बफर के साथ जेल को हटा दें. कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- Renaturing बफर निकालें और जेल करने के लिए बफर के विकास के 100 एमएल जोड़ने. कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- विकासशील बफर निकालें और जेल करने के लिए 100 एमएल के विकास बफर के और अधिक जोड़ने. 37 पर रातोंरात (16-18 घंटे) सेते डिग्री सेल्सियस
- विकासशील बफर निकालें और कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन के तहत विआयनीकृत जल के साथ तीन बार (5 मिनट प्रत्येक) कुल्ला.
- जेल स्कैन करने के लिए प्रोटीन मानक बैंड की सटीक स्थिति को बचाने के रूप में वे कम या जेल धुंधला के बाद दिखाई नहीं दे रहा हो जाएगा.
- जेल SimplyBlue Safestain के 20 एमएल जोड़कर जेल दाग. कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- SimplyBlue SafeStain और डे दाग कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 100 एमएल या अधिक विआयनीकृत जल में जेल निकालें.
- बेहतर परिणामों के लिए, कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर एक या उससे अधिक घंटे के लिए ताजा विआयनीकृत जल और सेते के साथ की जगह.
3. डेटा विश्लेषण
- ध्यान से पानी और एक प्लास्टिक शीट रक्षक में जगह से जेल को हटा दें.
- 300 डीपीआई या अधिक के एक संकल्प के साथ जेल स्कैन. झगड़ा प्रारूप (चित्रा 1A) में छवि सहेजें.
- ImageJ (या किसी अन्य इसी तरह के सॉफ्टवेयर) के साथ बैंड तीव्रता उपाय.
- ImageJ (चित्रा 1 ए) में TIFF फ़ाइल खोलें.
- काले और सफेद में कल्पना का चयन करके "छवि प्रकार>> 8 - बिट" (चित्रा 1 बी).
- आयताकार चयन उपकरण का उपयोग करने के लिए पहली बैंड रूपरेखा, एक आयत को कम से कम उच्च में दो बार की तुलना में यह व्यापक है (यह एक सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है) ड्राइंग.
- "1" या प्रेस का चयन करें "विश्लेषण> जैल> चुनें पहली लेन" और बैंड रेखांकित किया जाएगा.
- एक नया आयत दिखाई देते हैं, यह अगले बैंड करने के लिए कदम होगा और "> जैल> चुनें अगले लेन विश्लेषण" का चयन करें. दोहराएँ जब तक सभी बैंड (चित्रा 1 बी) का चयन कर रहे हैं.
- प्रेस "3" या "विश्लेषण> जैल> प्लॉट गलियों" प्रत्येक बैंड (चित्रा 1C) के लिए प्रोफ़ाइल साजिश उत्पन्न का चयन करें.
- सीधी रेखा चयन (पहले से ही स्वचालित रूप से चयनित किया जाना चाहिए) का प्रयोग आधार लाइनों आकर्षित इतना है कि ब्याज की चोटी एक पूरी तरह से संलग्न क्षेत्र है.
- छड़ी उपकरण का चयन करें और प्रत्येक चोटी के अंदर क्लिक करें चयन करने के लिए उसे.
- "विश्लेषण> जैल> लेबल चोटियों" प्रत्येक चयनित चोटी के लिए क्षेत्र के साथ एक मेज प्राप्त चुनें. ये आंकड़े इस तरह के रूप में प्लॉट किया जा सकता है (एफigure) 1D या एक चुना बैंड के मूल्य के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है. यह सामान्य विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब कई को दोहराने के जैल से मानों pooling के परिणामों के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
हम 11 अलग अलग सेल संस्कृति MMP-2 (चित्रा 1A) के विभिन्न मात्रा युक्त supernatants के साथ भरी हुई कुओं के साथ एक जेल दिखा. इस जेल का प्रत्यक्ष अवलोकन कुछ कुओं के बीच MMP-2 सांद्रता में स्पष्ट अंतर से पता चलता है. उदाहरण के लिए, यह स्पष्ट है कि कुओं # 4 और 5 ज्यादा # अच्छी तरह से 11 या # 10 से अधिक एमएमपी-2 होते हैं. बैंड के उद्देश्य मात्रा का ठहराव के लिए हम ImageJ सॉफ्टवेयर (चित्रा D-1B) के साथ densitometry का इस्तेमाल किया है, # अच्छी तरह से 11 और कुओं # 4 और 5 और एक लगभग 2 गुना में अंतर के बीच एक MMP-2 मात्रा में लगभग 4 गुना अंतर की पुष्टि # अच्छी तरह से 10 और कुओं # 4 और 5 के बीच एमएमपी-2 मात्रा.
चित्रा 1 जेलाटीन zymography MMP-2 के द्वारा जांच. एक, एक जिलेटिन जेल की स्कैन की गई छवि. खैर संख्या जेल के शीर्ष पर संकेत कर रहे हैं. बी, के रूप में समान जेल densitometry के लिए काले और सफेद में दिखाया गया है. प्रत्येक बैंड ImageJ में एक आयत के साथ चुना गया था. सी, दो densitometry प्रोफाइल के उदाहरण में दिखाया जेल के लिए ए और बी (बैंड # 4 और # 11). एक सीधी रेखा प्रत्येक चोटी के आधार पर तैयार किया गया था के लिए एक बंद क्षेत्र बनाने के लिए. डी, (बाएं) से पहले और बाद में ए और बी (दाएं) # 1 बैंड के घनत्व के लिए सामान्य में दिखाया गया है जेल के लिए पीक क्षेत्रों के प्लॉट.
चित्रा 2. यह आंकड़ा दर्शाता है कि कैसे zymography एक अर्द्ध मात्रात्मक तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम लगातार 7 कुओं में धारावाहिक dilutions (01:01 dilutions के चरणों) भरी हुई है और दोनों के समर्थक एमएमपी-2 और MMP-2 के लिए बैंड घनत्व मापा.
Discussion
हमने दिखा दिया है कि कैसे सेल संस्कृति supernatants में MMP-2 के zymographic विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए.
नमूने की राशि के लिए एक जेल पर लोड empirically मूल और ब्याज की एमएमपी के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए. भी थोड़ा पता लगाने को रोकने जबकि बहुत ज्यादा लोड हो रहा है लोड हो रहा है संतृप्ति के लिए नेतृत्व के रूप में वहाँ केवल इतना सब्सट्रेट एक protease बैंड के क्षेत्र में पचा सकता है हो सकता है. यदि आवश्यक हो, तो नमूना विआयनीकृत जल में बफर लोड हो रहा है या समय के विकास के साथ मिश्रण करने से पहले पतला होना कर सकते हैं डे रातोंरात से 4 घंटे के लिए कम किया जा सकता. यह भी संभव है concentrators (जैसे Millipore सूची UFC803024 #) का उपयोग कर समाधान में प्रोटीन ध्यान केंद्रित है. यदि बैंड मुश्किल से दिखाई रहते हैं, यह जैल के लिए समय की एक लंबी अवधि के लिए विकसित करने के लिए आवश्यक हो सकता है, भी 48 घंटे तक हो सकता है. जब टिशू कल्चर supernatants से नमूने की तैयारी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भ्रूण गोजातीय सीरम (और अन्य सीरा) एम एम पी है कि परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं शामिल होना चाहिए. इस कारण से, हम सीरम मुक्त माध्यम में संस्कृति के बाद हमारे supernatants के सभी एकत्र.
2.9 प्रोटोकॉल के पैराग्राफ और 2.10 में वर्णित washes पचा बैंड की धुंधला पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए आवश्यक हैं. लंबा धोने गुना अधिक पृष्ठभूमि निकालने के लिए, लेकिन यह भी मंद होगा जेल भर सब्सट्रेट के धुंधला हो जाना. यदि अब धोने बार जरूरी हैं, हम जेल हर कुछ घंटों स्कैनिंग की सिफारिश के लिए सबसे अच्छा विपरीत के साथ स्कैन का चयन करें.
इस तकनीक को अन्य एम एम पी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए,-9 एमएमपी जिलेटिन जैल पर पाया जा सकता है, और यह भी एक कम हद एमएमपी-1, एमएमपी-8, और एमएमपी-13 के रूप में जिलेटिन अपने पसंदीदा सब्सट्रेट नहीं है. MMP-1 और MMP-13 कोलेजन zymography पर सबसे अच्छा पता चला रहे हैं, जबकि कैसिइन एमएमपी-11 के लिए पसंदीदा सब्सट्रेट है और यह भी पता लगाने MMP-1 के, एमएमपी-3, एमएमपी-7, एमएमपी-12, और एमएमपी-13 के लिए अनुमति देता है 9. एमएमपी 7 (matrilysin) और collagenases (एमएमपी-1 और MMP-13) का पता लगाने जब कैसिइन या जिलेटिन जैल में कम स्तर पर मौजूद करने के लिए मुश्किल हैं. हेपरिन की जेल लोडिंग के समय में नमूना के अलावा काफी एमएमपी-7 के लिए पता लगाने की सीमा में सुधार. MMP-1 और MMP-13 के लिए, हेपरिन जेल करने के लिए जोड़ा जा electrophoretic रन के बाद 12 तरह के तहत पहले से ही है की जरूरत है.
चूंकि zymography और एंजाइमों के विकृतीकरण renaturation बाद enzymatic गतिविधि के उपाय, यह सभी नमूने में मौजूद एम एम पी की गतिविधि उपाय करेंगे. यह एंजाइमों, समर्थक एंजाइमों, और अंतर्जात inhibitors (जैसे TIMP-2) करने के लिए बाध्य एंजाइमों शामिल हैं. लेकिन यह संभव है के लिए सक्रिय एंजाइम बैंड के घनत्व की तुलना द्वारा और समर्थक एंजाइम है, जो एक थोड़ा उच्च आणविक भार होगा कि नमूने में एमएमपी सक्रियण के स्तर को निर्धारित है.
Zymography अक्सर एक एमएमपी की पहचान करने के लिए पर्याप्त नहीं है. ज्ञात आणविक भार मानकों के साथ एक एमएमपी के प्रवास के स्तर की तुलना की पहचान में मदद करता है, लेकिन यह नोट किया जाना चाहिए कि इन मानकों में से कुछ एक को कम करने के एजेंट होते हैं और जब गैर को कम करने की शर्तों के तहत प्रयोग किया जाता है वे अलग आणविक भार 9 का संकेत हो सकता है कि है. एक विकल्प के लिए परीक्षण के नमूने के रूप में एक ही जेल पर एक घुलनशील पुनः संयोजक एमएमपी लोड है. एम एम पी लेकिन अन्य प्रोटीन के साथ जुड़ा हो सकता है स्पष्ट आणविक भार में परिवर्तन उत्प्रेरण. चयनात्मक एमएमपी inhibitors औषधीय उपकरण के रूप में विकासशील बफर में ऊष्मायन के दौरान (या आधे में एक जेल में कटौती का हिस्सा) की पहचान के लिए जेल के लिए जोड़ा जा सकता है interest.A दूसरी तकनीक (वेस्टर्न ब्लाट immunocytochemistry, या एलिसा) के एमएमपी के लिए सिफारिश की है ब्याज की एमएमपी की पहचान में मदद करते हैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पश्चिमी blots पता लगाने के लिए सीमा अक्सर zymographic जैल के उन लोगों की तुलना में बहुत कम है, संभावित झूठी नकारात्मक परिणामों के लिए अग्रणी जब इस तकनीक का उपयोग करना चाहिए.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम प्रोटीन concentrators के उपयोग का सुझाव करने के लिए सेल संस्कृति supernatants में एम एम पी की एकाग्रता में वृद्धि करने के लिए डॉ. एस Ressler (आण्विक और सेलुलर जीवविज्ञान विभाग, चिकित्सा Baylor कॉलेज) को धन्यवाद देना चाहूंगा.
इस परियोजना श्रीमती क्लिफर्ड बड़ी व्हाइट ग्राहम संपन्न रिसर्च फंड और NIH / सीबी NIAMS (AR059838) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और करता एनआईएच की आधिकारिक दृश्य जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | |
| Power supply (model 302) | VWR international | 93000-744 | |
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | |
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Gel loading tips | VWR international | 53509-015 | |
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | |
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | |
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | |
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
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