Summary
Questo protocollo descrive una basata sulle attività di analisi per la rilevazione di metalloproteinasi della matrice in sovranatanti o fluidi corporei.
Abstract
Metalloproteinasi della matrice (MMP) sono contenenti zinco endopeptidasi. Si degradano le proteine per scissione di legami peptidici. Più di venti MMP sono stati identificati e sono divisi in sei gruppi in base alla loro struttura e specificità di substrato (collagenasi, gelatinasi, tipo a membrana [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, e altri). MMP svolgono un ruolo critico nella invasione delle cellule, la degradazione della cartilagine, il rimodellamento dei tessuti, la guarigione delle ferite, e l'embriogenesi. Essi hanno quindi partecipare sia i processi normali e nella patogenesi di molte malattie, come l'artrite reumatoide, il cancro o malattie polmonari croniche ostruttive 1-6. Qui ci concentreremo su MMP-2 (gelatinasi A, collagenasi di tipo IV), un MMP ampiamente espresso. Dimostreremo come rilevare MMP-2 nei supernatanti colture cellulari da zimografia, un uso comune, tecnica semplice, ma molto sensibile descritto per primo nel 1980 da C. Heussen e EB Dowdle 7-10. Questa tecnica è semi-quantitativa, si può quindi essere usato per determinare i livelli di MMP nei campioni di prova quando le concentrazioni note di MMP ricombinanti sono stati caricati sullo stesso gel 11.
Soluzioni contenenti MMP (ad esempio surnatanti di coltura cellulare, delle urine o siero) vengono caricati su un gel di poliacrilamide contenente dodecil solfato di sodio (SDS, per linearizzare le proteine) e la gelatina (substrato per la MMP-2). Il buffer di esempio è progettato per aumentare la viscosità del campione (per facilitare il carico gel), forniscono un colorante di tracciamento (blu di bromofenolo, di monitorare la migrazione del campione), di fornire le molecole denaturazione (a linearizzare le proteine), e controllare il pH del campione. Le proteine sono poi permesso di migrare sotto una corrente elettrica in un tampone di corsa progettata per fornire una velocità costante migrazione. La distanza di migrazione è inversamente correlata con il peso molecolare della proteina (piccole proteine muoversi più velocemente attraverso il gel di proteine di grandi dimensioni e quindi non migrano più in basso il gel). Dopo la migrazione, il gel viene posto in un buffer di rinaturazione delle proteine per permettere di ritrovare la loro struttura terziaria, necessari per l'attività enzimatica. Il gel viene posto in un buffer di sviluppo progettato per consentire la proteasi per digerire il suo substrato. Il buffer contiene anche lo sviluppo di p-aminophenylmercuric acetato (Apma) per attivare il non-proteolitico pro-MMP in MMP attiva. Il passo successivo consiste di colorazione del substrato (gelatina nel nostro esempio). Dopo aver lavato il colorante in eccesso il gel, le aree di digestione della proteasi appaiono come bande chiare. La più chiara la band, il più concentrato della proteasi in esso contenuti. Colorazione delle bande può essere determinata da densitometria, utilizzando un software come ImageJ, che consenta raffronti campione.
Protocol
1. Caricamento ed esecuzione del Gel
- Tutti i campioni devono essere preparati in modo adeguato per mantenere la funzione degli enzimi e utilizzato immediatamente dopo la raccolta o conservati congelati a -80 ° C. I campioni non devono contenere agenti riducenti (un β-mercaptoetanolo) o essere bollito prima di caricare gel.
- Aprire il sacchetto contenente un gel all'interno di una cassetta, la cassetta di risciacquo con acqua deionizzata.
- Rimuovere il nastro protettivo dalla parte inferiore della cassetta e il pettine dalla parte superiore del gel.
- Lavare i pozzetti tre volte con tampone di corsa (diluito in acqua deionizzata 1X).
- Posizionare il gel nella Mini-Cell, assicurando che il lato minore della cassetta volti verso l'interno. Bloccare in posizione con il cuneo tensione Gel. Il Mini-Cell permette di eseguire uno o due gel in parallelo.
- Riempire la parte superiore (interno) da camera con 1X tampone di corsa sopra il livello del pozzi, verificare eventuali perdite. In caso di perdite, rimuovere il buffer e riposizionare il gel.
- Riempire la camera inferiore con 1X tampone di corsa.
- Carico 10 l di proteine marker molecolari in un pozzetto.
- Mescolare una pari quantità di gel-caricamento del buffer e del campione e caricare nei pozzetti del gel con gel-loading punte (cambio tra un campione). Questi pozzi possono essere caricati fino a 20 microlitri totale.
- Mettere il coperchio sulla Mini-Cell e collegare i cavi degli elettrodi per l'alimentazione. Accendere l'alimentatore e impostare l'esecuzione a 125 V costante per 90 minuti. Controllare la formazione di piccole bolle sul filo della camera bassa, indicando circolazione di corrente.
- Quando si esegue il primo gel, monitorare i progressi della migrazione ogni 15 minuti, usando il blu di bromofenolo inclusi nel tampone di caricamento come indicatore. Lasciate che il gel fino a correre il colorante indicatore raggiunge il fondo del gel.
2. Rinaturazione e Sviluppo del Gel
- Per ogni gel, la preparazione di 100 ml di tampone 1X rinaturazione e 200 ml di denaturazione tampone, sia in acqua deionizzata.
- Quando il colorante blu bromofenolo inseguimento raggiunge il fondo del gel, passare l'alimentazione elettrica, aprire il Mini-Cell, e rimuovere il gel. Separare le due parti della cassetta con il coltello gel (o una spatola di pesatura). Tagliare un angolo per segnare la direzione del gel.
- Rimuovere accuratamente il gel dal cassetto e posto in un contenitore con 100 mL di tampone di rinaturazione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e scuotendo con cautela.
- Rimuovere il tampone rinaturazione e aggiungere 100 ml di sviluppo tampone al gel. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e scuotendo con cautela.
- Rimuovere il tampone sviluppo e aggiungere 100 mL di tampone più via di sviluppo per il gel. Incubare per una notte (16-18 ore) a 37 ° C.
- Rimuovere il tampone sviluppo e lavare tre volte (5 minuti ciascuno) con acqua deionizzata sotto agitazione a temperatura ambiente.
- Scansione del gel per salvare l'esatto posizionamento di bande di serie della proteina come diventeranno meno o non visibile dopo colorazione gel.
- Macchiare il gel con l'aggiunta di 20 ml di SimplyBlue Safestain al gel. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione.
- Rimuovere il SafeStain SimplyBlue e de-macchia il gel in 100 ml d'acqua più o deionizzata per un'ora a temperatura ambiente sotto agitazione.
- Per ottenere risultati migliori, sostituire con fresca acqua deionizzata e incubare per un'altra ora o più a temperatura ambiente sotto agitazione.
3. Analisi dei dati
- Rimuovere accuratamente il gel dall'acqua e posto in un protettore foglio di plastica.
- La scansione del gel con una risoluzione di 300 dpi o superiore. Salvare l'immagine in formato TIFF (Figura 1A).
- Misura intensità band con ImageJ (o un altro software simile).
- Aprire il file TIFF in ImageJ (Figura 1A).
- Visualizza in bianco e nero, selezionando "Immagine>> Tipo 8-bit" (Figura 1B).
- Utilizzare lo strumento di selezione rettangolare a delineare la prima band, disegnando un rettangolo almeno due volte più alto che largo (questo è un requisito software).
- Premere il tasto "1" o selezionare "Analizza> Gel> corsia Seleziona prima" e la band sarà delineato.
- Un nuovo rettangolo apparirà, spostarlo nella fascia successiva e selezionare "Analizza> Gel> corsia Seleziona". Ripetere fino a quando tutte le bande sono selezionati (Figura 1B).
- Premere "3" oppure selezionare "Analizza> Gel> corsie Plot" per generare il grafico di profilo per ogni banda (Figura 1C).
- Utilizzare la selezione in linea retta (dovrebbe essere già selezionata automaticamente) per tracciare linee di base in modo che il picco di interesse è un'area completamente recintata.
- Selezionare lo strumento bacchetta magica e fare clic all'interno di ogni picco per selezionarlo.
- Selezionare "Analizza> Gel> picchi Label" per ottenere una tabella con l'area di ciascun picco selezionata. Questi dati possono essere rappresentati come tali (F1D IGURA) o può essere normalizzata al valore di un gruppo scelto. Questa normalizzazione è particolarmente importante quando i valori da mettere in comune diverse gel replicare per determinare la significatività statistica dei risultati.
4. Rappresentante Risultati
Mostriamo un gel con 11 pozzi caricato con surnatanti diverse colture di cellule contenenti diverse quantità di MMP-2 (Figura 1A). L'osservazione diretta di questo gel mostra evidenti differenze nelle concentrazioni di MMP-2 tra alcuni dei pozzetti. Per esempio, è chiaro che i pozzi # 4 e 5 contengono molto di più MMP-2 che bene # 11 o anche ben # 10. Per la quantificazione oggettiva delle band che abbiamo usato densitometria con il software ImageJ (Figura 1B-D), confermando una differenza di circa 4 volte in MMP-2 importi tra bene # 11 e # pozzi 4 e 5 e una differenza di circa 2 volte a MMP-2 e gli importi compresi tra # 10 e # pozzi 4 e 5.
Figura 1. Rilevazione di MMP-2 da zimografia gelatina. A, L'immagine acquisita di un gel gelatina. I numeri sono ben indicate nella parte superiore del gel. B, gel Stessa Un mostrato in bianco e nero per la densitometria. Ogni banda è stato selezionato con un rettangolo in ImageJ. C, due esempi di profili di densitometria per il gel mostrato in A e B (bande # 4 e # 11). Una linea retta è stato redatto alla base di ogni picco di creare uno spazio chiuso. D, Plot delle aree di picco per il gel mostrato in A e B (a destra) normalizzazione prima (a sinistra) e dopo alla densità di banda # 1.
Figura 2. Questa figura dimostra come zimografia può essere usato come un semi-quantitativa tecnica. Abbiamo caricato diluizioni seriali (passi di 1:1 diluizioni) in 7 pozzi consecutivi e misurato la densità di banda sia per i pro-MMP-2 e MMP-2.
Discussion
Abbiamo dimostrato come eseguire l'analisi zymographic di MMP-2 nel surnatante di coltura cellulare.
La quantità di campione da caricare su un gel deve essere determinato empiricamente a seconda della provenienza e MMP di interesse. Caricamento troppo poco impedisce di rilevamento durante il caricamento di troppo può portare alla saturazione quanto non vi è solo substrato tanto una proteasi in grado di digerire nell'area della band. Se necessario, il campione può essere diluito in acqua deionizzata prima della miscelazione con tampone di caricamento o il tempo di sviluppo possono de ridotto da notte per 4 ore. E 'anche possibile concentrare le proteine in una soluzione che utilizza concentratori (es. catalogo Millipore # UFC803024). Se le bande rimangono poco visibile, può essere necessario per sviluppare il gel per un periodo di tempo più lungo, anche fino a 48 ore. Quando la preparazione dei campioni da surnatanti colture di tessuti, si deve rilevare che siero fetale bovino (e altri sieri) contiene MMP che possono influenzare i risultati. Per questa ragione, raccogliamo tutti i nostri surnatanti dopo cultura in mezzo privo di siero.
La lava di cui ai paragrafi 2.9 e 2.10 del protocollo sono necessari per rimuovere la colorazione di fondo delle bande digerito. Volte di più lavare rimuoverà più di fondo, ma anche debole la colorazione del supporto in tutto il gel. Se i tempi di lavaggio più lunghi sono necessari, si consiglia la scansione del gel ogni poche ore per selezionare la scansione con il miglior contrasto.
Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare altre MMP. Per esempio, MMP-9 possono essere rilevati su gel di gelatina, e anche in misura minore, MMP-1, MMP-8 e MMP-13 la gelatina non è il loro substrato preferito. MMP-1 e MMP-13 sono i migliori rilevati zimografia collagene, mentre la caseina è il substrato preferito per MMP-11 e permette anche per la rilevazione di MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12, e MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) e collagenasi (MMP-1 e MMP-13) sono difficili da individuare quando presente a bassi livelli di caseina o gel gelatina. L'aggiunta di eparina al campione al momento del carico gel migliora in modo significativo il limite di rilevamento per la MMP-7. Per MMP-1 e MMP-13, l'eparina deve essere aggiunto il gel dopo la corsa elettroforetica è già in corso 12.
Dal zimografia misura l'attività enzimatica dopo denaturazione e rinaturazione degli enzimi, si misura l'attività di tutti MMP presenti nel campione. Questo include gli enzimi, pro-enzimi, ed enzimi legati agli inibitori endogeni (ad esempio TIMP-2). E 'tuttavia possibile determinare il livello di attivazione MMP nel campione confrontando la densità di banda dell'enzima attivo e di quello del pro-enzima, che avrà un peso leggermente superiore molecolare.
Zimografia spesso non è sufficiente per identificare un MMP. Confronto del livello di migrazione di un MMP con nota standard di peso molecolare è di aiuto nella identificazione, ma va notato che alcune di queste norme contengono un agente riducente e che se usati in condizioni non riducenti possono indicare diversi pesi molecolari 9. Una possibilità è quella di caricare un MMP solubile ricombinante sullo stesso gel come campioni di prova. MMP può tuttavia essere associata con altre proteine, inducendo un cambiamento apparente peso molecolare. Gli inibitori selettivi MMP può essere aggiunta al gel (o parte di un gel tagliato a metà) durante l'incubazione in tampone di sviluppo come strumenti farmacologici per l'identità del MMP della tecnica interest.A secondo (Western Blot, immunocitochimica, o ELISA) si consiglia di aiuto per l'identificazione del MMP di interesse. Va notato che i limiti di rilevazione per Western Blot sono spesso molto inferiori a quelli di gel zymographic, che porta a risultati falsi-negativi quando si usa questa tecnica.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott. S. Ressler (Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare, Baylor College of Medicine) per aver suggerito l'uso di proteine concentratori per aumentare la concentrazione di MMP nei surnatanti di coltura cellulare.
Questo progetto è stato supportato anche da finanziamenti del Fondo di Clifford Sig.ra Elder Bianco ricerca Dotato Graham e il NIH / NIAMS (AR059838) al CB. I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | |
| Power supply (model 302) | VWR international | 93000-744 | |
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | |
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Gel loading tips | VWR international | 53509-015 | |
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | |
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | |
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | |
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
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