Summary
이 프로토콜은 문화 supernatants이나 체액의 매트릭스 metalloproteinases 검출을위한 활동 기반의 분석을 설명합니다.
Abstract
매트릭스 metalloproteinases (MMPs)는 아연 함유 endopeptidases 있습니다. 그들은 펩티드 채권 절단하여 단백질을 저하. 더보기보다 20 MMPs가 확인된과 구조와 기판 특이성 (collagenases, gelatinases, 멤브레인 타입 [MT - MMP] stromelysins, matrilysins, 등)에 따라 여섯 그룹으로 구분됩니다. MMPs는 세포 침공, 연골 저하, 조직 리모델링, 상처 치유, 그리고 embryogenesis에 중요한 역할을한다. 그들은 따라서 두 정상 프로세스 및 류마티스 관절염, 암, 또는 만성 폐쇄 폐 질환 1-6 많은 질병의 pathogenesis에 참여합니다. 여기서는 MMP - 2 (gelatinase A, 유형 IV collagenase), MMP 널리 표현에 초점을 맞출 것이다. 우리는 zymography 먼저 C. Heussen 및 EB 다우 70-10에 의해 1980 년에 설명 일반적으로 사용되는 매우 민감한 아직 단순하고, 기술에 의해 세포 배양 supernatants에서 MMP - 2를 검출하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 이 기술 세미 양적이며, 그것은 따라서 재조합 MMP 알려진 농도가 같은 겔 11 로드할 때 테스트 샘플에서 MMP 수준을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
그리고 젤라틴 (MMP - 2 기판), MMPs (예 : 세포 배양 supernatants, 소변, 또는 혈청)이있는 솔루션은 나트륨 dodecyl 황산염 (단백질 linearize하는 SDS)를 포함하는 polyacrylamide 젤에로드됩니다. 샘플 버퍼 (겔 로딩을 촉진하기) 샘플 점도를 높이기 위해 만들어진 것입니다, 추적 염료 (bromophenol 파란색, 샘플 마이 그 레이션을 모니터)를 제공 denaturing 분자를 (단백질 linearize)을 제공하고, 샘플의 산도를 제어합니다. 단백질은 다음 일정 마이 그 레이션 속도를 제공하기위한 실행 버퍼의 전류에 따라 마이 그 레이션하는 것이 허용됩니다. 이주의 거리는 반대로 단백질의 분자량 (작은 단백질이 큰 단백질은보다 젤을 통해 신속하게 이동하고 따라서 젤 아래 추가로 마이 그 레이션)와 상관 있습니다. 마이 그 레이션 후, 젤은 단백질이 효소 활동에 필요한 자신의 차 구조를, 다시 수 있도록 renaturing 버퍼에 배치됩니다. 젤은 다음 프로 테아제는 기판을 소화 수 있도록 설계된 개발 버퍼에 배치됩니다. 개발 버퍼는 또한 활성화된 MMPs에 비 proteolytic 프로 MMPs를 활성화하기 위해 P - aminophenylmercuric 아세테이트 (APMA)가 포함되어 있습니다. 다음 단계는 기판 (우리의 예제에서는 젤라틴) 염색법으로 구성되어 있습니다. 겔에서 여분의 염료를 세척 후, 테아제 소화 영역은 분명 밴드로 나타납니다. 명확하게 밴드가 더 집중 프로 테아제는가 포함되어 있습니다. 밴드 얼룩 강도는 다음 샘플 비교 있도록 같은 ImageJ 같은 소프트웨어를 사용, densitometry에 의해 결정하실 수 있습니다.
Protocol
1. 로딩과 젤 실행
- 모든 샘플은 효소의 기능을 유지하기 위해 충분히 준비하고 수집 후 즉시 사용하거나 -80에서 냉동 보관해야 ° C. 샘플 감소 대리인이 없어야합니다 (예 : β - 메르 캅 토 에탄올) 또는 겔로드하기 전에 삶은 수 있습니다.
- 카세트 안에 젤이 들어있는 주머니를 열고, 탈이온수와 카세트를 씻어.
- 카세트의 바닥과 젤 상단에서 빗에서 보호 테이프를 제거합니다.
- 실행 버퍼 (탈이온수에 1X로 희석)와 우물을 세 번 씻어.
- 미니 셀, 카세트의 작은 면이 안쪽에 직면 있도록에 젤를 놓습니다. 젤 장력 웨지와 장소에 잠금. 미니 셀은 병렬로 하나 또는 두 개의 젤을 실행할 수 있습니다.
- 웰스 해발 1X 실행 버퍼 맨 (내부) 챔버를 기입 어떤 누출이 있는지 확인합니다. 누출의 경우에는 버퍼를 제거하고 젤 조정.
- 1X 실행 버퍼와 하부 챔버 입력합니다.
- 물론 하나의 단백질 분자 마커 10 μL를로드합니다.
- 겔 - 로딩 팁 (각 샘플 사이의 변경)를 사용하여 젤의 우물로 겔 로딩 버퍼 및 샘플과 부하의 동일한 금액을 섞는다. 이러한 웰스는 20 μL 총와 로드할 수 있습니다.
- 미니 셀에 뚜껑을 놓고 전원 공급 장치에 전극 코드를 연결합니다. 에있는 전원 공급 장치 스위치 90 분 동안 지속적인 125 V에서 실행으로 설정합니다. 현재 순환을 나타내는 하단 챔버의 철사에 작은 거품의 형성을 확인합니다.
- 첫 번째 젤을 실행하는 경우, 지표로 읽어 버퍼에 포함된 bromophenol 파란색을 사용하여 마이 그 레이션 매 15 분 진행 상황을 모니터링합니다. 표시기 염료가 젤 하단에 도달할 때까지 겔 실행하자.
2. 젤 Renaturing 및 개발
- 각 젤 들어, 탈이온수 모두에 1X renaturing 버퍼와 버퍼를 denaturing 200 ML 100 ML을 준비합니다.
- bromophenol 푸른 추적 염료는 젤 하단에 도달하면, 전원 공급 장치를 끄고 미니 셀을 열고, 그리고 젤을 제거하십시오. 겔 나이프 (또는 무게 주걱)를 사용하여 카세트의 두 측면을 분리합니다. 젤의 방향을 표시하기 위해 모서리를 잘라.
- 조심스럽게 100 ML renaturing 버퍼와 함께 용기에 카세트와 장소에서 젤을 제거하십시오. 부드러운 교반과 실온에서 30 분 알을 품다.
- renaturing 버퍼를 제거하고 젤로 버퍼를 개발 100 ML를 추가합니다. 부드러운 교반과 실온에서 30 분 알을 품다.
- 개발 버퍼를 제거하고 겔을 개발하여 버퍼의 100 ML 더 추가합니다. 37 (16~18시간) 밤새 품어 ° C.
- 개발 버퍼를 제거하고 실온에서 부드럽게 교반 하에서 탈이온수로 세 번 (5 분 각각) 헹굼.
- 그들은 겔 얼룩 후 작거나 보이지 않는가 될로서 단백질 표준 밴드의 정확한 위치를 저장하는 젤 스캔.
- 겔에 SimplyBlue Safestain 20 ML을 추가하여 겔 스테인. 부드러운 교반하에 실온에서 1 시간 품어.
- SimplyBlue SafeStain 부드러운 선동에 따라 실내 온도에 한 시간 동안 100 ML 이상의 탈이온수에 드 얼룩 젤을 제거합니다.
- 보다 나은 결과를 위해 부드러운 교반에 따라 상온에서 한 시간 이상 신선한 탈이온수과 부화로 바꿉니다.
3. 데이터 분석
- 조심스럽게 플라스틱 시트 보호대에 물과 장소에서 젤을 제거하십시오.
- 300 DPI 이상의 해상도로 젤을 검사합니다. TIFF 형식 (그림 1A)에서 이미지를 저장합니다.
- ImageJ (또는 다른 유사한 소프트웨어)와 함께 밴드 농도를 측정.
- ImageJ (그림 1A)에서 TIFF 파일을 엽니다.
- 선택하여 흑백의 시각화 '이미지를> 입력> 8 비트 "(그림 1B).
- 적어도 두 번 이상은 (이 소프트웨어 요구 사항입니다)보다 넓은 사각형을 그리기, 처음 밴드를 대략적으로 사각형 선택 도구를 사용하십시오.
- "1"을 누르거나 "분석> 젤> 선택 피르스트 레인 '과 밴드가 설명됩니다를 선택합니다.
- 새로운 사각형이 나타납니다 다음 밴드로 이동하고 "분석> 젤> 선택 옆에있는 차선 '을 선택합니다. 모든 밴드는 (그림 1B)을 선택 때까지 반복합니다.
- "3"을 누르거나 각 밴드 (그림 1C)에 대한 프로필 계획을 생성하기 위해 "분석> 젤> 플롯 차선"를 선택하십시오.
- 관심의 정상은 완전히 밀폐된 공간되도록 기본 라인을 그릴 수있는 직선을 선택 (이미 자동으로 선택한다)를 사용합니다.
- 지팡이 도구를 선택하고 그것을 선택 각각의 최대 내부를 클릭하십시오.
- 선택한 각 피크에 대한 영역 테이블을 얻기 위해 "분석> 젤> 라벨 봉우리"를 선택하십시오. 이러한 데이터는 (F 같은 꾸몄다 수 있습니다igure의 1D) 또는이 선택한 밴드의 가치에 정상화 수 있습니다. 결과 통계적 중요성을 결정하기 위해 여러 복제 젤에서 값을 풀링 때 정상화가 특히 중요합니다.
4. 대표 결과
우리는 MMP - 2 (그림 1A)의 다른 금액을 포함하는 다양한 세포 배양 supernatants와 함께 로드된 11 우물로 젤을 보여줍니다. 이 젤의 직접 관찰이 우물의 일부 사이 MMP - 2 농도에서 확실한 차이를 보여줍니다. 예를 들어, 우물 # 4와 5는 훨씬 더 MMP - 2 잘 # 11 또는 # 10 잘보다가 포함되어있다는 사실을 분명하다. 밴드의 객관적인 부량을 위해 우리는 잘 # 11 우물 # 4, 5 및 약 2 배 차이 MMP - 2 금액의 약 4 배 차이를 확인, ImageJ 소프트웨어 (그림 1B - D)와 densitometry를 사용했습니다 잘 # 10 우물 # 4와 5 사이에서 MMP - 2 정도입니다.
그림 1. 젤라틴 zymography에 의해 MMP - 2의 감지. 젤라틴의 젤, 스캔한 이미지. 그럼 숫자가 젤 상단에 표시됩니다. B 같은 젤처럼 검정과 densitometry를 위해 흰색 표시됩니다. 각 밴드는 ImageJ에 사각형과 함께 선정되었다. C,에 표시된 겔에 대한 densitometry 프로파일의 두 가지 예로 A와 B (밴드 # 4와 # 11). 직선은 닫힌 영역을 만들려면 각 피크의 기지에 그립습니다. D, 밴드 # 1의 밀도에 A와 B 전 (왼쪽) 후 (오른쪽) 정상화에 표시된 젤에 대한 피크 영역의 플롯.
그림 2.이 그림은 zymography가 세미 양적 기술로 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 우리는 7 연속 우물의 시리얼 dilutions을 (1:1 dilutions의 단계)로드 및 프로 MMP - 2와 MMP - 2 모두에 대한 밴드의 밀도를 측정했습니다.
Discussion
우리는 세포 배양 supernatants에서 MMP - 2의 zymographic 분석을 수행하는 방법을 증명하고있다.
젤에 로드할 샘플의 양은 경험적으로 관심의 기원과 MMP에 따라 결정되어야합니다. 단백 분해 효소가 밴드의 영역에서 소화 수있는 너무 많은 기판이 그대로 너무 로딩하는 동안 거의 감지하지 않도록 할 수도로드하면 채도가 발생할 수 있습니다. 필요한 경우, 샘플은 이전에 읽어 버퍼 또는 개발 시간과 믹싱에 탈이온수에 희석 수있는 데 4 시간이 하루에서 단축하실 수 있습니다. 그것은 concentrators (예 : Millipore 카탈로그 # UFC803024)를 사용하여 솔루션에 단백질을 집중하는 것도 가능합니다. 밴드가 겨우 보이는 남아있다면, 그것도 최대 48 시간, 시간의 긴 기간 동안 젤을 개발해야 할 수도 있습니다. 조직 문화 supernatants에서 샘플을 비교할 때, 그것은 태아 소 혈청 (및 기타 세라)가 결과에 영향을 미칠 수 MMPs를 포함 것을인지해야합니다. 이러한 이유로, 우리는 혈청이없는 배지에서 문화 이후 우리 supernatants 모두 수집합니다.
프로토콜의 단락 2.9 및 2.10에 명시된 세척은 소화 밴드의 얼룩 배경을 제거하기 위해 필요합니다. 더 이상 세척 시간은 젤 내내 기판의 얼룩 더 많은 배경을 제거 하겠지만도 희미합니다. 이상 세척 시간이 필요하는 경우, 우리는 최고의 명암으로 스캔을 선택 젤 매일 몇 시간을 스캔하는 것이 좋습니다.
이 기술은 다른 MMPs를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 젤라틴들이 선호하는 기판이 아니므로 예를 들어, MMP - 9는 낮은 정도 MMP - 1, MMP - 8과 MMP - 13 또한 젤라틴 젤에 대한 감지, 그리고 수 있습니다. 카제인은 MMP - 11에 대한 선호하는 기판이며, 또한 MMP - 1의 탐지, MMP - 3, MMP - 7, MMP - 12 및 MMP - 13을 허용하면서 MMP - 1과 MMP - 13은 최고의 콜라겐 zymography에 감지 9. MMP - 7 (matrilysin)와 collagenases (MMP - 1과 MMP - 13) 때 카제인이나 젤라틴 젤 낮은 수준에서 현재 감지하기가 어렵습니다. 겔 로딩 시간에 샘플로 헤파린의 또한 MMP - 7에 대한 검색 제한을 대폭 향상시킵니다. MMP - 1과 MMP - 13의 경우, 헤파린은 전기 실행이 방법은 12 세 미만 이미 후 겔에 추가되어야합니다.
zymography이 효소의 변성 및 renaturation 후 효소 활동을 측정 때문에, 그것은 샘플에있는 모든 MMPs의 활동을 측정합니다. 이것은 효소, 프로 효소, 그리고 내생 억제제 (예 : 팀프 - 2)에 바운드 효소를 포함합니다. 그것은 활성 효소의 밴드 밀도를 비교하여하고 약간 높은 분자량을 가지고되는, 프로 효소의의 예제에서 MMP 활성화 수준을 결정하는 그러나이 가능합니다.
Zymography은 종종 MMP을 확인하기에 충분하지 않습니다. 알려진 분자량 표준 MMP의 마이 그 레이션 수준의 비교는 식별에 도움이 되나요하지만 이러한 표준의 일부가 감소 요원을 포함하고 비 절감 조건에서 사용할 때 그들이 9 가지 분자 무게를 나타낼 수 있다고 언급한다. 옵션은 테스트 샘플과 같은 겔에 가용성 재조합 MMP를 로드할 수 있습니다. MMPs는 그러나 겉보기 분자량의 변화를 유도, 다른 단백질에 연결되어있을 수 있습니다. 선택적 MMP 억제제는 interest.A 초 기술 (웨스턴 블롯, immunocytochemistry, 또는 엘리사)의 MMP가하는 것이 좋습니다 정체성에 약리 도구로 개발 버퍼에 부화 중에 젤 (또는 반 젤 컷의 일부)에 추가할 수 있습니다 관심 MMP의 식별에 도움이됩니다. 그것은 서양 Blots에 대한 검색 제한이 기술을 사용하면 잠재적으로 거짓 - 부정적인 결과로 이어지는, 자주 zymographic 젤보다 훨씬 낮은 것을 지적해야합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 세포 배양 supernatants에서 MMPs의 농도를 증가 단백질 concentrators의 사용을 제안에 대한 박사 S. 레슬러를 (분자 및 세포 생물학의학과 의학의 베일러 대학) 감사드립니다.
이 프로젝트는 부인이 클리포드 엘더 화이트 그레이엄 둘러 싸인 연구 기금과 CB에 대한 NIH / NIAMS (AR059838)에서 보조금에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | |
| Power supply (model 302) | VWR international | 93000-744 | |
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | |
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Gel loading tips | VWR international | 53509-015 | |
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | |
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | |
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | |
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
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