Summary
Bu protokol, kültür süpernatantlar veya vücut sıvıları matriks metalloproteinazların tespit etmek için bir faaliyet tabanlı test açıklamaktadır.
Abstract
Matriks metalloproteinazlar (MMP) çinko içeren endopeptidazlar. Bunlar peptit bağlarının ayrılması ile proteinlerin bozulmasına yol açar. Yirmiden fazla MMP'ler tespit edilmiş ve kendi yapısı ve substrat özgüllüğü (kolajenazlar, gelatinases, membran tipi [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, ve diğerleri) göre altı gruba ayrılır. MMP hücre işgali, kıkırdak bozulması, doku remodeling, yara iyileşmesi, ve embriyogenez kritik bir rol oynamaktadır. Bu nedenle hem normal süreçleri ve romatoid artrit, kanser veya kronik obstrüktif akciğer hastalığı 1-6 gibi pek çok hastalıkların patogenezinde katılırlar . Burada, MMP-2 (jelatinaz A, Tip IV kollajenaz), yaygın olarak ifade MMP üzerinde durulacak. Biz tarafından 1980 yılında açıklanan ilk olarak C. Heussen ve EB Dowdle 7-10 yaygın olarak kullanılan, çok hassas ama basit ve teknik zymography, MMP-2 hücre kültürü süpernatantlar nasıl algılamak için gösterecektir . Bu teknik, yarı-kantitatif, bu nedenle aynı jel 11 rekombinant MMP bilinen konsantrasyonlarda yüklendiğinde test örneklerinde MMP düzeylerini belirlemek için kullanılan olabilir.
Ve jelatin (MMP-2 için substrat), MMP (örneğin hücre kültürü süpernatantlar, idrar veya serum) içeren çözeltiler, sodyum dodesil sülfat (proteinler linearize SDS) içeren bir poliakrilamid jel üzerine yüklenir. Örnek tamponu (jel yükleme kolaylaştırmak için) örnek viskozitesini arttırmak için tasarlanmış, bir izleme boya (Bromophenol Mavi örnek göç izlemek için), denatüre moleküllerin (proteinler linearize) sağlamak ve örnek pH kontrolü. Proteinler, daha sonra sürekli bir göç oranı sağlamak üzere tasarlanmıştır çalışan bir tampon bir elektrik akımı altında göç izin verilir. Göç mesafe proteinin moleküler ağırlığı (küçük proteinler jel ile büyük proteinler daha hızlı hareket ve bu nedenle jel daha aşağı göç) ile ters ilişkilidir. Geçişten sonra, jel proteinler enzimatik aktivite için gerekli üçüncül yapısı, yeniden sağlamak için bir renaturing tampon yerleştirilir. Jel sonra proteaz substrat sindirmek için izin verecek şekilde tasarlanmıştır gelişmekte olan bir tampon yerleştirilir. Gelişmekte olan tampon da aktif MMP-proteolitik olmayan pro-MMP etkinleştirmek için p-aminophenylmercuric asetat (APMA) içerir. Bir sonraki adım, substrat (bizim örneğimizde jelatin) boyama oluşur. Jel kapalı aşırı boya yıkadıktan sonra, proteaz sindirim alanları net bantları olarak görünür. Net grup, daha konsantre proteaz içerir. Band boyanma yoğunluğu gibi ImageJ gibi bir yazılım kullanarak, örnek karşılaştırma için izin dansitometrisi tarafından belirlenir.
Protocol
1. Yükleme ve Jel Koşu
- Tüm numuneler enzimlerin fonksiyonunu korumak için yeterince hazırlıklı ve toplandıktan sonra hemen kullanılabilir veya -80 dondurularak saklanan olmalıdır ° C Örnekler indirgeyici ajanlar içermeyen (böyle bir β-mercaptoethanol) veya jel yüklemeden önce kaynatılmalıdır.
- Bir kaset içinde jel içeren kese aç kaseti, deiyonize su ile durulayın.
- Kasetin alt ve üst jel tarak koruyucu bandı çıkarın.
- Çalışan tampon (1X için deiyonize su ile seyreltilmiş) kuyular üç kez durulayın.
- Mini-Cell, kaset küçük yan içe karşı karşıya olduğu sağlamak jel yerleştirin. Jel Gerilim Kama ile yerine kilitleyin. Mini Hücre paralel olarak, bir ya da iki jeller çalışmasına olanak tanır.
- Kuyuları seviyesi üstünde 1X tamponu ile (iç) üst kamara doldurun, herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sızıntı durumunda, tampon çıkarın ve jel yeniden konumlandırmak.
- 1X tamponu ile alt kamara doldurun.
- Iyi bir protein moleküler marker 10 mcL yükleyin.
- Jel yükleme ipuçları (her bir numune arasında değişmektedir) kullanarak jel kuyulara jel yükleme tamponu ile örnek ve yük eşit miktarda karıştırın. Bu kuyular 20 mcL toplam yüklenebilir.
- Mini-Cell kapak yerleştirin ve elektrot kabloları güç kaynağına bağlamak. Güç kaynağı açın ve 90 dakika boyunca sabit 125 V çalıştırmak için ayarlayın. Mevcut dolaşımını gösteren küçük kabarcıkların oluşumu, alt odasının tel kontrol edin.
- Ilk jel çalışırken, bir göstergesi olarak yükleme tamponu dahil Bromophenol Mavi kullanarak, her 15 dakikada bir göç ilerlemeyi izlemek. Göstergesi boya jel alt ulaşıncaya kadar jel çalıştıralım.
2. Jel Renaturing ve Gelişmekte Olan
- Her jel için, 1X renaturing tampon ve tampon denatüre 200 ml, 100 ml deiyonize su hem de hazırlar.
- Bromophenol Mavi izleme boya jel alt ulaştığında, güç kaynağını kapatın, Mini-Cell açık ve jel çıkarın. Jel bıçak kullanarak (ya da bir tartı spatula) kaset iki tarafı ayırın. Jel yönünü işaretlemek için bir köşe kesin.
- Jel 100 ml renaturing tamponu ile bir kap içine kaset ve yerden dikkatlice çıkarın. Yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Renaturing tamponu çıkarın ve jel tampon gelişmekte 100 ml. Yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Gelişmekte olan tamponu çıkarın ve jel, gelişmekte olan tampon 100 mL daha eklemek. 37 ° gece boyunca inkübe edin (16-18 saat) ° C
- Gelişmekte olan tampon çıkartın ve oda sıcaklığında yavaşça sallanarak altında deiyonize su ile üç kez (5 dakika) sonra durulayın.
- Jel, jel boyama sonra daha az ya da görünmez olacak gibi standart protein bantları tam konumlandırma kaydetmek için tarayın.
- Leke Jel 20 ml SimplyBlue Safestain ekleyerek jel. Yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
- SimplyBlue SafeStain ve yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında bir saat için 100 ml veya daha fazla deiyonize su içinde de leke jel çıkarın.
- Daha iyi sonuçlar için, yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında bir saat veya daha fazla taze deiyonize su ve inkübe ile değiştirin.
3. Veri Analizi
- Jel, su ve bir plastik levha koruyucusu yerden dikkatlice çıkarın.
- 300 dpi veya daha yüksek çözünürlüğe sahip jel tarayın. TIFF formatında görüntü kaydetme (Şekil 1A).
- ImageJ (veya başka bir benzer yazılım) ile bant yoğunlukları ölçün.
- ImageJ (Şekil 1A) TIFF dosya açın.
- Seçerek siyah ve beyaz olarak gözünüzde canlandırın "Image> Yazım> 8-bit" (Şekil 1B).
- En az iki kat daha yüksektir (bu bir yazılım gereksinimi) geniş daha bir dikdörtgen çizim, ilk grup anahat dikdörtgen seçim aracını kullanın.
- "1" tuşuna basın veya "Analiz> Jeller> Seç ilk şeritli" ve grubun ana hatlarıyla olacak.
- Yeni bir dikdörtgen görünür, bir sonraki grup taşımak ve "Analyze> Jeller> Seç sonraki şeritli" seçecektir. Bütün bantları (Şekil 1B) seçilene dek tekrarlayın.
- "3" tuşuna basın veya her bir band (Şekil 1C) Profil arsa üretmek için "Analyze> Jeller> Arsa şerit" seçeneğini seçin.
- Ilgi tepe tamamen kapalı bir alan olduğunu, bu nedenle temel çizgiler çizmek için, düz bir çizgi seçimi (zaten otomatik olarak seçili olmalıdır) kullanın.
- Değnek aracını seçin ve seçmek için her tepe noktası içini tıklatın.
- Seçilen her pik alanı içeren bir tablo elde etmek için "Analyze> Jeller> Etiket tepeler" seçin. Bu veriler, (F gibi çizilebilirigure 1D) veya seçilen bir grubun değerine normalize edilebilir. Bu normalleşme, sonuçların istatistiksel olarak anlamlı belirlemek için çeşitli çoğaltmak jeller değerler havuzu özellikle önemlidir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Biz, MMP-2 (Şekil 1A) farklı miktarlarda içeren farklı hücre kültürü süpernatantlar yüklü 11 kuyusu olan bir jel göstermektedir. Bu jel, doğrudan gözlem, MMP-2 konsantrasyonları bazı kuyuların arasında belirgin farklılıklar gösterir. Örneğin, kuyular # 4 ve 5 çok daha iyi # 11 veya # 10 MMP-2 içerdiği açıktır. Bantlar objektif ölçümü için de # 11 ve kuyu # 4 ve 5 ve yaklaşık 2 kat fark arasında MMP-2 miktarlarda yaklaşık 4 kat fark teyit ImageJ yazılım (Şekil 1B-D) ile dansitometrisi kullanmış MMP-2 de # 10 ve kuyu # 4 ve 5 arasında tutarındadır.
Şekil 1, MMP-2 jelatin zymography Algılama . Jelatin jel Taranan görüntü. Peki numaraları jel üst kısmında gösterilir. B, Aynı jel gibi siyah ve beyaz dansitometrisi için gösterilir. Her bandın ImageJ bir dikdörtgen ile seçildi. C, A ve B iki örnek gösterilen jel dansitometrisi profilleri (bantları # 4 ve # 11). Kapalı bir alan oluşturmak için her tepe dibinde düz bir çizgi çizildi. D, A ve B # 1 bant yoğunluğu önce (sol) ve sonrası (sağ) normalleştirme gösterilen jel için pik alanları Arsa.
Şekil 2 Bu rakam zymography yarı-kantitatif bir teknik olarak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir . 7 kuyularda üst üste seri dilüsyonları (01:01 dilüsyonları adımlarla) yüklenir ve pro-MMP-2 ve MMP-2 hem de bant yoğunlukları ölçüldü.
Discussion
Biz, MMP-2 hücre kültürü Süpernatantları zymographic analizi gerçekleştirmek için nasıl göstermiştir.
Ampirik ilgi kökeni ve MMP bağlı olarak örnek bir jel üzerinde yük miktarı tespit edilmelidir. Sadece bir proteaz bant alanında sindirimi çok substrat var çok yüklenirken biraz algılanmasını önlemek çok Yükleniyor doygunluk yol açabilir. Gerekirse, örnek, yükleme tamponu ya da gelişmekte olan zaman ile karıştırılarak önce deiyonize su ile seyreltilmiş de 4 saat için bir gecede indirilmiştir. Bu konsantratörleri (örneğin Millipore katalog # UFC803024) kullanarak bir çözüm proteinlerin konsantre olmak da mümkündür. Bantlar zor görünür kalırsa, hatta 48 saate kadar, uzun bir süre için jeller geliştirmek için gerekli olabilir. Doku kültürü süpernatantlar örnekler hazırlarken, fetal sığır serumu (ve diğer sera) sonuçları etkileyebilir MMP'ler içerdiğini belirtmek gerekir. Bu nedenle, serum serbest ortamda kültürden sonra bizim süpernatantlar toplamak.
Protokolün paragraf 2.9 ve 2.10 'da açıklanan yıkar sindirilir bantların boyama arka plan çıkarmak için gereklidir. Daha uzun yıkama süreleri boyunca substrat jel boyama daha fazla arka plan kaldırmak, ancak aynı zamanda loş. Uzun yıkama süreleri gerekli ise, jel, en iyi kontrast ile tarama seçmek için birkaç saatte bir tarama önermektedir.
Bu teknik diğer MMP'ler tespit etmek için kullanılabilir. Örneğin, jelatin tercih ettikleri substrat olarak MMP-9 daha düşük bir oranda MMP-1, MMP-8 ve MMP-13 Jellerin tespit ve olabilir. Kazein, MMP-11 için tercih edilen substrat ve algılama MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 ve MMP-13 için de sağlar MMP-1 ve MMP-13 en iyi kollajen zymography tespit 9 - MMP-7 (matrilysin) ve kolajenazlar (MMP-1 ve MMP-13), kazein veya Jellerin düşük seviyelerde tespit etmek zordur. Jel yükleme sırasında örnek heparin eklenmesi için algılama sınırı MMP-7 önemli ölçüde artırır. MMP-1 ve MMP-13, heparin elektroforetik vadede şekilde 12 altında zaten sonra jel eklenecek gerekiyor.
Zymography enzimlerin denatürasyon ve Yeniden doğallaştırmanın sonra enzimatik aktivite ölçer, örnek mevcut tüm MMP aktivitesini ölçmek. Bu enzimler, pro-enzimler ve endojen inhibitörleri (örneğin TIMP-2) bağlı enzimler içerir. Bu örnek MMP aktivasyonunun aktif enzim grubun yoğunluğu karşılaştırarak ve biraz daha yüksek moleküler ağırlığa sahip olan, pro-enzim düzeyini belirlemek için ancak mümkündür.
Zymography genellikle bir MMP tanımlamak için yeterli değildir. Karşılaştırma bilinen molekül ağırlığı standartları ile MMP göç düzeyi belirlenmesinde yardımcı olur ama bu standartların bazı indirgen içerir ve bu düşürücü olmayan koşullar altında kullanıldığında 9 farklı molekül ağırlıkları gösterebilir dikkat edilmelidir. Test örnekleri aynı jel üzerinde bir çözünür rekombinant MMP yüklemek için bir seçenek. MMP Ancak, molekül ağırlığı belirgin bir değişiklik indükleyen diğer proteinler ile ilişkili olabilir. Seçici MMP inhibitörleri interest.A ikinci tekniği (Western Blot, immünsitokimya veya ELISA) MMP tavsiye edilir kimliği farmakolojik araçları gibi gelişmekte olan tampon kuluçka sırasında jel (ya da yarım bir jel kesme parçası) eklenebilir ilgi MMP belirlenmesinde yardımcı olur. Western blot için algılama sınırları, bu tekniği kullanarak bir potansiyel yalancı negatif sonuçlara yol açan, sık sık zymographic jeller oranla çok daha düşük olduğu unutulmamalıdır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Dr. S. Ressler (Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü, Baylor College of Medicine) hücre kültürü Süpernatantları MMP'lerin konsantrasyonu artırmak için protein yoğunlaştırıcıların kullanımı önermek için teşekkür etmek istiyorum.
Bu proje Bayan Clifford Yaşlı Beyaz Graham donatılmış Araştırma Fonu ve CB NIH / NIAMS (AR059838) hibe ile desteklendi. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | |
| Power supply (model 302) | VWR international | 93000-744 | |
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | |
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Gel loading tips | VWR international | 53509-015 | |
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | |
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | |
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | |
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
- Luo, J. The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex. Cerebellum. 4, 239-245 (2005).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Lagente, V., Boichot, E. Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases. J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).
- Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).
- Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochem. , 102-196 (1980).
- Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review. Biochimie. 87, 265-272 (2005).
- Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Biotechniques. 38, 73-83 (2005).
- Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).
- Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases. Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).
- Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases. Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).
