Summary
Abstract
Nous démontrons les techniques de base pour l'enregistrement de patch-clamp présynaptique au calice de Held, un terminal de mammifères nerveuses du système nerveux central. Enregistrements électrique de la borne présynaptique permettent la mesure des potentiels d'action, les courants des canaux calciques, la fusion des vésicules (exocytose) et l'absorption de la membrane ultérieures (endocytose). La fusion des vésicules contenant des neurotransmetteurs entraîne la membrane de la vésicule d'être ajouté à la membrane cellulaire du calice. Cette augmentation de la quantité de membrane cellulaire est mesurée par une augmentation de la capacité. La réduction subséquente de la capacité d'endocytose indique, le processus d'absorption de la membrane ou le retrait de la membrane du calice. Endocytose, est nécessaire pour maintenir la structure du calice et il est également nécessaire de former des vésicules qui sera rempli avec les neurotransmetteurs pour les événements futurs exocytose. Capacité d'enregistrements au calice de Held ont permis de mesurer directement et rapidement la libération vésiculaire et l'endocytose ultérieure dans un terminal nerveuses du système nerveux central des mammifères. En outre, l'activité correspondante postsynaptique peut être mesurée simultanément en utilisant des enregistrements appariés. Ainsi, une image complète de l'activité présynaptique et postsynaptique électrique à une synapse du système nerveux central est réalisable à l'aide de cette préparation. Ici, les méthodes pour la préparation de tranche, les caractéristiques morphologiques pour l'identification des calices de Held, les techniques de patch base de serrage, et des exemples d'enregistrements capacité à mesurer l'exocytose et l'endocytose sont présentés.
Protocol
Installation Patch Clamp:
Optique: L'optique est très important de trouver une cellule bien, et d'établir la position de celui-ci.
Essayez d'obtenir une image claire des cellules: des arêtes vives, douces prospectifs cellule.
Analyser le champ entier de chercher des bonnes MNTB cellules principales avec calice. Tournez-vaisselle pour chercher calices sous différents angles. Dans un premier temps, il est OK pour la pratique sur le ballon en forme de borne.
Choisissez la cellule à la surface de la tranche, ou dans la couche 2 ème cellule. Cibler le premier 1 / 3 de la cellule avec pipette
Identifier les calices: Recherchez une double membrane (voir Figure 1), et tournez le plat tranche pour la voir sous des angles différents pour aider à confirmer qu'il est un calice.
Figure 1
Profondeur de Calyx: Calyx devrait être sur la surface ou en tant que proche de la surface que possible.
Surface disponible pour patcher: Utilisez le bouton mise au point fine sur la loupe pour déterminer comment "de large / profondeur" le calice est. Par exemple, ~ 10% d'un tour complet sur la mise au point fine vous donnera plus de surface suffisante pour patch sur.
Etanchéité sur une cellule présynaptique: Pour se rendre à la cellule attachée, pour trouver un «petit» de déformation sur la surface de la cellule due à la pression pos (~ 0.15psi) dans la pipette, utilisez manipulateur d'exécuter la pipette haut, le bas et à travers, et même dans la surface du terminal presyn pour obtenir une bonne déformation, puis relâchez la pression et appliquer le vide, si et tant que nécessaire.
PULSE, le programme d'acquisition de données:
Besoin d'augmenter la taille du tampon avant la première utilisation, et chaque fois que nécessaire par la capacité d'échantillonnage.
Besoin de charger les macros modifiés à chaque fois.
Potentiel jonction liquide: Solution d'enregistrement Presyn est-11mV (11mV négatif).
Presyn: Cslow = ~ 15 pF
Rs comp pour presyn: 10 msec, 65% (plus de compensation possible, peut-w / out oscillations)
Avant l'enregistrement de capacité: détente Courant de test (10 mV, 10 msec saut) pour voir si la détente est monoexponentielle, à savoir si presyn terme peut être modélisé par un seul compartiment.
Filtres: Situé à 30 kHz et 10 kHz (filtre de Bessel 1 et 2, respectivement) pendant la mesure de relaxation, pour s'assurer une composante rapide n'est pas raté.
Pendant les enregistrements mini, Xinsheng utilisé 10 kHz et 5 kHz. LGW m'a demandé d'utiliser seulement le filtre 1 fixé à 30 kHz pour s'assurer que nous pouvons mesurer temps de montée de mini.
Nommage des fichiers: 7 chiffres 000mmxx, où mm est le mois (ou mois et année) et xx est le nombre de cellules.
Nettoyage Lignes Solution: Lignes nettoyé à la fin d'expérience avec 20 ml de HCl 0,1 M suivie par 200 ml ddH2O.
Solutions externes sont recyclés, la vitesse de la pompe est de 20-30 min.
(Solution de retour de la chambre de bain reflue dans l'éprouvette graduée).
Mettre en place trois lignes sortantes pour assurer aspiration suffisante.
Solution pipette d'enregistrement présynaptiques: ~ 310 milli osmolaire
Solution Presyn doit être ~ 310 mOsm pour empêcher l'accès R-augmenter durant l'expérimentation.
Presyn pipette solution est différente de la pipette postsyn solution (Presyn a ATP & GTP par ex.).
TTX-TEA Solution (pour isoler les courants Ca):
- Essayez d'appliquer après le scellement, ou même le rapiéçage, sur la cellule, comme TEA dans des blocs de solution de K-canaux et dépolarise la cellule. Ce n'est pas bon pour la cellule. Pour la même raison, il ne serait pas possible de réutiliser la tranche après TTX est appliquée.
- Comparez la réponse première et la dernière de la cellule, ou une tranche pour vérifier tout effet d'une dépolarisation prolongée.
- TTX est utilisé à 1 uM au lieu de 0,5 uM donc l'effet est plus rapide. Besoin d'attendre moins de temps après avoir changé de solutions.
Tranches de coupe
Paramètres Vibratome:
- 70Hz vibrations latérales
- Amplitude: 1,0 mm
- Vitesse avant 0,01 à 0,02 mm / s tout en réduisant les tranches avec calice, 0,1 contraire épaisseur: 180 um (~ 150um dans les animaux plus âgés)
Tranches incuber à 37 º C pendant 1 heure (temps de coupe comprend), c'est à dire, laisser dans le bain à 15-20 minutes après la coupe.
Pipettes:
Presyn: 03/05 au 04/05 MQ au premier abord, de 3,0 à 3,5 MQ où se sentir plus confiants
Utilisez manuel Extracteur pour définir les paramètres. Utilisez la fonction de retard parce que le verre est épais (retards de 200 ou 1 travail)
Verre de type: borosilicaté, paroi standard, pas de filament
Diamètre extérieur: 2,0 mm
Le diamètre intérieur 1,16 mm
Longueur: 7,5 cm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
