Summary
Abstract
Wir zeigen die grundlegenden Techniken für die präsynaptische Patch-Clamp-Aufzeichnung am Kelch der Held, ein zentralen Nervensystem von Säugetieren Nervenendigung. Elektrische Aufnahmen aus den präsynaptischen Terminal ermöglichen die Messung der Aktionspotentiale, Calcium-Kanal-Ströme, Vesikelfusion (Exozytose) und anschließende Membran-Aufnahme (Endozytose). Die Fusion von Vesikeln mit Neurotransmitter bewirkt, dass die Vesikelmembran an die Zellmembran der Kelch hinzugefügt werden. Dieser Anstieg in Höhe von Zellmembran ist eine Erhöhung der Kapazität gemessen. Die anschließende Reduktion der Kapazität zeigt Endozytose, den Prozess der Membran die Aufnahme oder Streichung aus dem Kelch Membran. Endozytose, ist notwendig, um die Struktur der Kelch zu halten und es ist auch notwendig, um Vesikel, die mit Neurotransmitter für zukünftige Exozytose Ereignisse gefüllt werden bilden. Kapazität Aufnahmen am Kelch von Held haben es möglich gemacht, um direkt und schnell messen vesikuläre Freisetzung und anschließende Endozytose in einem Säuger-ZNS Nervenendigung. Darüber hinaus können die entsprechenden postsynaptischen Aktivität gleichzeitig mit gepaart Aufnahmen gemessen werden. So ein vollständiges Bild von der präsynaptischen und postsynaptischen elektrische Aktivität an einem zentralen Nervensystems Synapse ist erreichbar mit diesem Präparat. Hier werden die Methoden zur Scheibe Vorbereitung, morphologische Merkmale zur Identifizierung von Kelchen der Held, grundlegende Patch-Clamp-Techniken und Beispiele der Kapazität Aufnahmen Exozytose und Endozytose Maßnahme.
Protocol
Patch-Clamp-Setup:
Optik: Die Optik ist sehr wichtig, eine gute Zelle zu finden, und um die Position der es zu etablieren.
Versuchen Sie, ein klares Bild von den Zellen zu erhalten: scharfe Kanten, weich aussehende Zelle.
Scan das gesamte Feld, für gute MNTB wichtigsten Zellen mit angeschlossenem Kelch zu suchen. Drehen Gericht für Kelche aus verschiedenen Blickwinkeln betrachten. Zunächst ist es OK, um auf Ballon-förmigen Klemme Praxis.
Pick-Zellen an der Oberfläche des Slice, oder in der 2. Zellschicht. Ziel der ersten 1 / 3 rd der Zelle mit Pipette
Identifizieren Hopfenzapfen: für ein Doppelzimmer Membran (siehe Abbildung 1) Look, und drehen Sie die Scheibe Gericht, es aus verschiedenen Blickwinkeln sehen, um zu bestätigen, dass es ein Kelch ist.
Abbildung 1
Tiefe der Kelch: Calyx sollte auf der Oberfläche oder als nahe an der Oberfläche wie möglich.
Zur Verfügung stehende Fläche für das Patchen: Verwenden Sie Fein-Fokus-Knopf am Mikroskop zu bestimmen, wie "breit / tief" der Kelch ist. Zum Beispiel werden ca. 10% einer vollen Umdrehung der Feinfokussierung Ihnen mehr als genug Fläche, um auf Patch.
Abdichtung auf einen präsynaptischen Zelle: Um zu Zelle angebracht zu bekommen, für einen "kleinen" Verformung auf der Zelloberfläche durch pos Druck (~ 0.15psi) in die Pipette suchen, verwenden Sie Manipulator Pipette laufen nach oben, unten und quer, und sogar in der Oberfläche des presyn Terminal, um eine gute Verformung zu bekommen, dann lassen Sie Druck und Unterdruck anwenden, wenn und soweit notwendig.
PULSE-, Datenerfassungs-Programm:
Brauchen Sie, um Puffergröße vor dem ersten Gebrauch zu erhöhen, und wenn durch Stichproben Kapazität erforderlich.
Brauchen Sie laden modifizierten Makros jeder Zeit.
Flüssige Junction Potential: Presyn Recording Solution-11mV (negative 11mV).
Presyn: Cslow = ~ 15 pF
Rs comp für presyn: 10 us, 65% (mehr Entschädigung kann möglich w / out Schwingungen)
Vor der Aufnahme Kapazität: Prüfstrom Entspannung (10 mV, 10 ms Sprung) zu sehen, ob Entspannung monoexponentielle ist, dh ob presyn Begriff, der von einem einzigen Innenraum modelliert werden kann.
Filter: Set mit 30 kHz und 10 kHz (Bessel-Filter 1 und 2) während der Entspannung Mess-, um sicherzustellen, dass eine schnelle Komponente nicht auf verfehlt.
Während Mini-Aufnahmen verwendet Xinsheng 10 kHz und 5 kHz. LGW hat mich gebeten, nur Filter 1 Satz bei 30 kHz verwenden, um sicherzustellen, dass wir Anstiegszeit von Mini messen.
Dateien benennen: 7-stellig 000mmxx, wobei mm Monat (oder Monat und Jahr) und xx ist die Zellzahl.
Cleaning Solution Lines: Zeilen am Ende des Experiments mit 20 ml 0,1 M HCl gereinigt, gefolgt von 200 ml ddH2O.
Externe Lösungen recycelt werden, ist Pumpendrehzahl 20-30 Umdrehungen pro Minute.
(Lösung der Rückkehr aus Bad Kammer fließt zurück in den Messzylinder).
Set up 3 abgehende Leitungen, um eine ausreichende Saugleistung zu gewährleisten.
Pipette Präsynaptische Recording Solution: ~ 310 Millisekunden osmolaren
Presyn Lösung muss ~ 310 mOsm zu R-Zugang Anstieg im Experiment zu verhindern.
Presyn Pipettenlösung unterscheidet sich von postsyn Pipettenlösung (Presyn hat ATP & GTP für ex.).
TTX-TEA-Lösung (Ca Strömen Isolat):
- Versuchen Sie, nach dem Versiegeln oder sogar Patches gelten, auf die Zelle, wie TEA in Lösung Blöcke K-Kanäle und depolarisiert die Zelle. Das ist nicht gut für die Zelle. Aus dem gleichen Grund ist es vielleicht nicht möglich sein, die Scheibe Wiederverwendung nach TTX angewendet wird.
- Vergleichen Sie die erste und die letzte Antwort der Zelle, oder ein Stück für eine Wirkung anhaltender Depolarisation zu überprüfen.
- TTX ist bei 1 uM statt 0,5 uM verwendet, so ist der Effekt schneller. Benötigen Sie weniger Zeit nach dem Wechsel Lösungen warten.
Cutting Slices
Vibratom Einstellungen:
- 70Hz seitlichen Schwingungen
- Amplitude: 1,0 mm
- Fahrgeschwindigkeit 0,01-0,02 mm / sec beim Schneiden Scheiben mit Kelch, 0,1 ansonsten Dicke: 180 &mgr; m (~ 150um bei älteren Tieren)
Scheiben bei 37 º C für 1 Stunde (einschließlich Schneiden Zeit), dh, lassen in Bad 15-20 Minuten nach dem Schneiden.
Pipetten:
Presyn: 3,5-4,5 MOhm auf den ersten, 3,0 bis 3,5 MOhm, wenn sich sicherer fühlen
Verwenden Sie puller Handbuch Einstellungen vornehmen. Verwenden Sie Delay Feature, denn Glas ist dick (Verzögerungen von 200 oder 1 Arbeitsplatz)
Glass Art: Borosilikatglas, Standard-Wand, kein Filament
Außendurchmesser: 2,0 mm
Innendurchmesser 1,16 mm
Länge: 7,5 cm
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