Summary
Abstract
우리는 헬드, 포유류의 중추 신경의 신경 단말기의 꽃받침에 presynaptic 패치 클램프 녹음을위한 기본 기술을 보여줍니다. presynaptic 터미널에서 전기 녹음 작업 잠재력, 칼슘 채널 전류, 소포의 융합 (exocytosis)와 후속 막 이해 (endocytosis)의 측정을 수 있습니다. 신경 전달 물질을 포함한 vesicles의 융합이 꽃받침의 세포막에 추가하는 소포 막 발생합니다. 세포막의 금액이 증가 커패시턴스의 증가로 측정됩니다. 커패시턴스의 후속 감소 endocytosis, 멤브레인 이해 또는 꽃받침 막에서 제거하는 과정을 나타냅니다. Endocytosis은 꽃받침의 구조를 유지하기 위해 필요하고 또한 앞으로 exocytosis 이벤트에 대한 신경 전달 물질로 가득합니다 vesicles를 형성하는 것이 필요합니다. 개최의 꽃받침에 커패시턴스 레코딩은 가능한 직접 빠르게 소낭성의 릴리스와 포유 동물 CNS 신경 터미널에서 후속 endocytosis을 측정하기 위하여 만들었습니다. 또한, 해당 postsynaptic 활동이 동시에 결합하여 레코딩을 사용하여 측정할 수 있습니다. 따라서 중추 신경계의 버렸네에서 presynaptic 및 postsynaptic 전기 활동의 완전한 그림이 준비를 사용하여 달성됩니다. 여기, 슬라이스 준비, 개최, 기본 패치 클램핑 기술 꽃받침의 복수의 식별 형태학의 기능 및 exocytosis와 endocytosis를 측정 커패시턴스 레코딩의 예제에 대한 방법은 제공됩니다.
Protocol
패치 클램프 설정 :
광학 : 좋은 세포를 찾으려면, 그리고 그것의 지위를 확립하기 위해 광학은 매우 중요합니다.
날카로운 모서리, 소프트 보이는 세포 : 세포의 명확한 이미지를보십시오.
첨부 꽃받침 잘 MNTB 교장 세포 찾기 위해 전체 필드를 검사합니다. 다른 각도에서 꽃받침의 복수를 찾는 요리를 회전합니다. 처음에는 그것은 풍선 모양의 터미널에서 연습을 확인합니다.
슬라이스의 표면에 세포를 선택하거나, 2 차 전지 레이어 인치 피펫과 세포의 첫번째 3분의 1 차를 대상으로
Calyxes을 파악하면 : 이중 막 (그림 1 참조)을 찾아, 그것이 꽃받침 있는지 확인 수 있도록 여러 각도에서 볼 수있는 슬라이스 접시를 돌린다.
그림 1
칼리의 깊이 : 칼리는 표면에이거나 가능한 표면에 가까이해야합니다.
패치를 사용할 수 표면 : 확인하기 위해 현미경에 사용 미세 초점 노프 방법 "깊이 / 폭"꽃받침입니다. 예를 들어, 잘 집중할 전체 차례 ~ 10 %는 당신에게에 패치 충분한 면적 이상을 제공할 것입니다.
presynaptic 세포에 실링 : 연결된 세포에 도착하려면, 피펫의 POS 압력 (~ 0.15psi)에 의한 세포의 표면에 "작은"변형을보고, 아래와 전역, 피펫을 실행하는 조작하는 사람을 사용하여, 심지어로 필요한 경우와 같은 좋은 변형을 얻기 위해 presyn 단말기의 표면은, 다음, 압력을 릴리스하고 흡입을 적용합니다.
PULSE, 데이터 수집 프로그램 :
처음 사용하기 전에 버퍼 크기를 증가하고, 언제든지 샘플링 용량을 필요로합니다.
수정된 매크로 매번로드해야합니다.
잠재 액체 융티온 : Presyn 녹화 솔루션 (부정적 11mV)입니다 - 11mV.
Presyn : Cslow = ~ 15 PF
presyn을위한 RS 광고 : 10 μsec, 65 % (더 많은 보상 수도 있습니다 가능한 W / 아웃 oscillations)
레코딩 용량하기 전에 테스트 현재 휴식 (10 뮤직 비디오, 10 밀리초 점프)이 휴식이 monoexponential되고 있는지 여부, 즉 presyn 용어가 하나의 구획으로 모델 수 있는지 여부.
필터 : 빠른 구성 요소를 놓쳤다하지 않도록 휴식을 측정하는 동안 30 kHz에서 10 kHz에서 (각각 베셀 필터 1, 2)에서 설정합니다.
미니 녹음하는 동안, Xinsheng 10 kHz에서와 5kHz를 사용합니다. LGW 우리가 미니의 상승 시간을 측정할 수 있도록 30 kHz에서에서만 필터 1 세트를 사용하는 나에게 물었다.
파일 이름 : 7 자리 mm 한달입니다 000mmxx (또는 달과 연도)과 XX는 핸드폰 번호입니다.
솔루션 라인 청소 : 0.1 M HCL 20 ML와 실험 끝에 청소 린스 200 ML ddH2O 다음.
외부 솔루션을 재활용, 펌프 속도는 20-30 RPM입니다.
(목욕 챔버에서 돌아오는 솔루션 눈금 실린더에 다시 흐르고).
충분한 흡입을 보장하기 위해 3 나가는 라인을 설정합니다.
피펫 Presynaptic 녹화 솔루션 : ~ 310 밀리 Osmolar
Presyn 솔루션 실험 기간 동안 R - 액세스 증가를 방지하기 위해 ~ 310 mOsm해야합니다.
Presyn 피펫 솔루션은 postsyn 피펫 용액 (Presyn은 은퇴한에 대한 ATP 및 GTP 수 있습니다.) 다릅니다.
TTX - 티 솔루션 (CA 전류를 분리) :
- 솔루션 블록 K - 채널에서 차 같이, 세포에, 실링, 또는 패치 이후에 적용하려고하고 세포를 depolarizes. 이것은 세포에 좋은하지 않습니다. 같은 이유로, 그것은 TTX가 적용된 후 슬라이스를 다시 사용할 수 없을 수도 있습니다.
- 세포 또는 장기 탈분극의 효과를 확인하기 위해 슬라이스의 첫 번째와 마지막 응답을 비교합니다.
- 효과가 빨리되도록 TTX는 1 μm의 대신에 0.5 μm의에 사용됩니다. 솔루션을 변경한 후에는 더 적은 시간을 기다릴 필요.
절단 조각
Vibratome 설정 :
- 70Hz 수평 진동
- 진폭 : 1.0 mm
- 꽃받침 조각과를 깎다가 전달 0.1 달리 두께가 0.01-0.02 mm / 초 속도 : 180 μm의를 (~ 150이전 동물 μm의)
조각은 1 시간 (절삭 시간을 포함), 즉 15~20분 절단 후 욕조에서 떠날에 대한 37 º C에서 알을 품다.
Pipettes :
Presyn : 처음 MΩ 3.5-4.5, 3.0-3.5 MΩ 더 자신감
설정을 설정하는 풀러 설명서를 사용합니다. 유리 두께 때문에 지연 기능을 사용하여 (200 또는 1 일의 지연)
유리 유형 : Borosilicate, 표준 벽, 아니 필라멘트
외경 : 2.0 mm
내경 1.16 mm
길이 : 7.5 cm
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