Summary
Abstract
Se demuestra las técnicas básicas para la grabación de presináptica de patch clamp en el cáliz de Held, un mamífero nervioso central terminal nerviosa del sistema. Registros eléctricos de la terminal presináptica permitir la medición de potenciales de acción, las corrientes de los canales de calcio, la fusión de vesículas (exocitosis) y la absorción de la membrana posterior (endocitosis). La fusión de vesículas que contienen neurotransmisores provoca la membrana de la vesícula que se añade a la membrana celular del cáliz. Este aumento en la cantidad de membrana celular se mide como un aumento de la capacidad. La consiguiente reducción de capacidad indica la endocitosis, el proceso de absorción de la membrana o la eliminación de la membrana del cáliz. Endocitosis, es necesario mantener la estructura del cáliz, y también es necesario para formar vesículas que se llenará con el neurotransmisor de la exocitosis eventos futuros. Grabaciones de capacitancia en el cáliz de Held han hecho posible medir directamente y con rapidez la liberación vesicular y la endocitosis posterior en un terminal nervioso SNC de los mamíferos. Además, la actividad postsináptica correspondientes se pueden medir simultáneamente mediante el uso de grabaciones de pares. Por lo tanto una imagen completa de la actividad eléctrica presináptica y postsináptica en la sinapsis del sistema nervioso central que se puede lograr utilizando esta preparación. En este caso, los métodos para la preparación de corte, las características morfológicas para la identificación de los cálices de las técnicas de Held, parche básico de sujeción, y los ejemplos de las grabaciones de capacidad para medir la exocitosis y la endocitosis se presentan.
Protocol
Setup Patch Clamp:
Óptica: La óptica es muy importante encontrar un buen celular, y para establecer la posición de la misma.
Trate de obtener una imagen clara de las células: los bordes afilados, aspecto suave de la célula.
Escanear todo el campo en busca de buenas células MNTB principal con cáliz unido. Gire plato en busca de los cálices desde diferentes ángulos. En un primer momento, está bien practicar en forma de globo terminal.
Recogida de células en la superficie de corte, o en la capa de 2 º de la célula. Objetivo de la primera 1 / 3 de la celda con una pipeta
La identificación de cálices: Busque una doble membrana (ver Figura 1), y girar el plato división para ver desde diferentes ángulos para ayudar a confirmar que se trata de un cáliz.
Figura 1
La profundidad del Cáliz Cáliz debe estar en la superficie o lo más cerca posible de la superficie.
La superficie disponible para parchear: Use la perilla de enfoque fino en microscopio para determinar cómo "de ancho / profundo" es el cáliz. Por ejemplo, alrededor del 10% de una vuelta completa en el enfoque fino le dará más de superficie suficiente para el parche en.
Sellado en una célula presináptica: Para llegar a la celda adjunta, busque una "pequeña" deformación en la superficie de la célula debido a la presión de punto de venta (~ 0.15psi) en la pipeta, el uso manipulador de ejecutar la pipeta hacia arriba, abajo ya través, y en hasta la superficie de la terminal presyn para obtener una deformación bueno, entonces liberar la presión y el efecto de succión, siempre y cuando sea necesario.
PULSE, el programa de adquisición de datos:
Necesidad de aumentar el tamaño del búfer antes del primer uso, y siempre que sea necesario por la capacidad de toma de muestras.
Necesidad de cargar macros modificada cada vez.
Junction potencial líquido: solución de grabación Presyn es-11mV (11mV negativo).
Presyn: Cslow = ~ 15 pF
Rs un borrador de presyn: 10 microsegundos, el 65% (más la compensación podrá posible w / las oscilaciones)
Antes de capacidad de grabación: relajación Corriente de prueba (10 mV, 10 mseg salto) para ver si la relajación es monoexponencial, es decir, ya sea a presyn puede ser modelada por un solo compartimiento.
Filtros: Situado a 30 kHz y 10 kHz (filtro de Bessel 1 y 2, respectivamente) durante la medición de la relajación, para asegurarse de que un componente de rápido no está perdido.
En las grabaciones mini, Xinsheng utiliza 10 kHz y 5 kHz. LGW me pidió que utilice sólo un filtro ajustado a 30 kHz para asegurarse de que se puede medir tiempo de subida de mini.
Los archivos de nombres: 7 dígitos 000mmxx, donde mm es el mes (o mes y año) y xx es el número de células.
Limpieza de líneas de solución: Líneas de limpieza al final del experimento con 20 ml de HCl 0,1 M seguido por 200 ml ddH2O.
Soluciones externas son reciclados, velocidad de la bomba es de 20-30 rpm.
(Solución de regresar de la cámara de baño fluye hacia el cilindro graduado).
Establecido tres líneas de salida para asegurar la succión suficiente.
Adición de la solución de grabación presináptica: ~ 310 milisegundos osmolar
Solución Presyn debe ser ~ 310 mOsm para prevenir R-aumentar el acceso durante el experimento.
Presyn solución de la pipeta es diferente de postsyn pipeta solución (Presyn ha ATP y GTP por ej.).
TTX-TEA solución (para aislar las corrientes de Ca):
- Trate de aplicar después de sellar, o parches, incluso, en la célula, como TEA en los bloques de solución de K-canales y despolariza la célula. Esto no es bueno para la célula. Por la misma razón, puede que no sea posible volver a usar el corte después de TTX se aplica.
- Comparar la respuesta primera y la última de la célula, o una rebanada para comprobar si hay algún efecto de la despolarización prolongada.
- TTX se utiliza en una M en lugar de 0,5 M de modo que el efecto es más rápido. Necesidad de esperar menos tiempo después de cambiar las soluciones.
Rebanadas de corte
Vibratome ajustes:
- 70Hz vibraciones laterales
- Amplitud: 1,0 mm
- La velocidad de avance 0,01-0,02 mm / seg, mientras cortaba rebanadas de cáliz, de lo contrario 0.1 Espesor: 180 micras (~ 150micras en los animales más viejos)
Rebanadas de incubar a 37 º C durante 1 hora (incluye el tiempo de corte), es decir, dejar en el baño de 15-20 minutos después del corte.
Pipetas:
Presyn: 3,5 a 4,5 mW en un primer momento, desde 3,0 hasta 3,5 mW cuando se sienten más seguros
Extractor de uso manual para establecer la configuración. Utilice la función de retraso porque el vidrio es grueso (retrasos de 200 o un trabajo)
Vidrio tipo: borosilicato, de pared estándar, sin filamentos
Diámetro exterior: 2.0 mm
Diámetro interior de 1,16 mm
Longitud: 7,5 cm
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