Summary
Abstract
Biz Held, memeli bir merkezi sinir sistemi sinir terminaline kaliks presinaptik yama kelepçe kayıt için temel teknikler göstermektedir. Presinaptik terminal Elektrik kayıtları aksiyon potansiyelleri, kalsiyum kanal akımları, vezikül füzyon (ekzositoz) ve daha sonraki membran alımı (endositoz) ölçümüne izin verir. Nörotransmitter içeren veziküller füzyon kaliks hücre zarının eklenecek vezikül membran neden olur. Bu artış miktarı hücre zarının kapasitans bir artış olarak ölçülür. Kapasitans sonraki azalma endositoz, zar alımı veya kaliks zarı çıkarıldıktan süreci gösterir. Endositoz, kaliks yapısını korumak için gerekli olan ve aynı zamanda gelecekteki ekzositoz olayları için nörotransmitter ile dolu olacak veziküller oluşturmak için gereklidir. Tutulan kaliks Kapasitans kayıtları mümkün veziküler serbest bırakılması ve bir memeli santral sinir sistemi sinir terminal sonraki endositoz doğrudan ve hızlı bir şekilde ölçmek için yaptık. Buna ek olarak, ilgili postsinaptik aktivite eşleştirilmiş kayıtları kullanılarak aynı anda ölçülebilir. Bu nedenle bir merkezi sinir sistemi sinaps presinaptik ve postsinaptik elektriksel aktivitenin tam bir resim bu preparat kullanılarak başarılabilir. Burada, dilim hazırlanması, tanımlanması için düzenlenen temel yama sıkma teknikleri kalikslere morfolojik özellikleri ve kapasitans kayıtları ve endositoz ekzositoz ölçmek için örnekler için yöntemler sunulmaktadır.
Protocol
Patch Kelepçe Kurulum:
Optik: iyi bir hücre bulmak için, ve bu pozisyonunu kurmak için optik çok önemlidir.
Keskin kenarları, yumuşak görünümlü cep: hücrelerinin net bir görüntü elde etmeye çalışın.
Ekli kaliks iyi MNTB ana hücreleri aramak için tüm alan tarayın. Çanağı, farklı açılardan kalikslere bakmak için. İlk başta, bu balon şeklindeki terminal üzerinde uygulama OK.
Dilim yüzeyinde hücre seçin, ya da 2. hücre katmanı . Pipet yardımıyla hücre ilk 1 / 3 üncü hedefleyin
Calyxes Tanımlama: bir çift membran (bkz. Şekil 1) arayın ve bir kaliks olduğunu doğrulamaya yardımcı olmak için farklı açılardan görmek için dilim çanağı .
Şekil 1
Kaliks Derinliği: Kaliks yüzey ya da mümkün olduğunca yüzeye yakın.
Belirlemek için kullanılabilir yama Yüzey: mikroskopta Kullanım ince odak topuzu ne kadar "derin / geniş" kaliks . Örneğin, ince odak tam bir dönüş yaklaşık% 10 üzerine yama için yeterli yüzey alanı daha fazla verecektir.
Presinaptik hücre üzerine Sızdırmazlık: ekli hücre elde etmek için, pipet (~ 0.15psi) pos basınç nedeniyle hücre yüzeyinde bir "küçük" bir deformasyon, aşağı ve karşısında, pipet çalıştırmak için manipülatör kullanmak ve hatta içine presyn terminal yüzey iyi bir deformasyon elde etmek için, gerekirse ve sonra, basınç tahliye ve emme geçerli.
PULSE, veri toplama programı:
İlk kullanımdan önce tampon boyutunu artırmak ve zaman örnekleme kapasitesi ile gerekli ihtiyacınız var.
Değiştirilmiş makrolar her zaman yüklemeniz gerekir.
Potansiyel Sıvı Junction: Presyn Kayıt Çözümü (negatif 11mV)-11mV.
Presyn: Cslow = ~ 15 pF
Presyn Rs comp: 10 μsec,% 65 (daha fazla tazminat muhtemel w / çıkış salınımlar)
Kayıt kapasitans önce: Test rahatlama (10 mV, 10 msn atlama) rahatlama monoexponential olup olmadığını görmek için, yani presyn terim, tek bir bölme ile modellenen olabilir mi.
Filtreler: rahatlama ölçüm sırasında hızlı bir bileşeni kaçırmış değil emin olmak için 30 kHz ve 10 kHz (Bessel filtre sırasıyla 1 ve 2) ayarlayın.
Mini kayıtları sırasında, Xinsheng 10 kHz ve 5 kHz kullanılır. LGW mini yükselme zamanı ölçebilir, emin olmak için 30 kHz sadece filtre 1 set kullanmak için bana sordu.
Files adlandırma: 7 basamak mm ay 000mmxx (veya ay ve yıl) ve xx hücre sayısı.
Çözüm Hatları Temizleme: 20 ml 0.1 M HCl ile deney sonunda temizlenir Hatları 200 ml ddH2O izledi.
Harici Çözümler geri dönüşümlü, pompa hızı 20-30 dak.
(Banyo odasına dönen çözüm dereceli silindirin içine geri akar).
Yeterli emiş sağlamak amacıyla 3 giden hatları ayarlayın.
Pipet Presinaptik Kayıt Çözüm: ~ 310 mili osmolar
Presyn Çözüm ~ 310 mOsm deney sırasında R erişim artmasını önlemek gerekir.
Presyn pipet çözüm postsyn pipet solüsyonu (Presyn ATP ve GTP ex vardır.) Farklı.
TTX-ÇAY Çözüm (Ca akımlar izole etmek için):
- Çözüm blokları K kanalları TİM olarak, hücre üzerine, sonra sızdırmazlık, ya da bile yama uygulamak için çalışın ve hücre depolarizes. Bu hücre için iyi değildir. Aynı nedenden dolayı, dilim TTX uygulandıktan sonra yeniden mümkün olmayabilir.
- Hücre, ya da dilim uzamış depolarizasyon herhangi bir etkisi kontrol etmek için ilk ve son yanıt karşılaştırın.
- TTX etkisi hızlıdır 0.5 mcM 1 mcM yerine kullanılır. Çözüm değiştirdikten sonra daha az süre beklemek gerekiyor.
Kesme Dilimleri
Vibratome ayarları:
- 70Hz yanal TİTREŞİMLER
- Genlik: 1.0 mm
- İleri, kaliks ile dilimleri kesme 0.1 aksi kalınlığı 0,01-0,02 mm / sn hız: 180 mikron (~ 150yaşlı hayvanlarda mikron)
Dilimler, 1 saat (kesme zamanı içerir), yani, 15-20 dakika sonra kesme banyo terk 37 º C'de inkübe edin.
Pipetler:
Presyn: ilk başta M 3,5-4,5 3.0-3.5 M daha güvende hissediyorum
Çektirmenin manuel ayarlarını ayarlamak için kullanın. Cam kalın olması nedeniyle gecikme özelliğini kullanın (200 veya 1 çalışma gecikmeler)
Cam tipi: Borosilikat, standart duvar, hiçbir filament
Dış Çap: 2.0 mm
İç Çapı 1.16 mm
Uzunluk: 7,5 cm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
