Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère

Summary

Ce protocole vidéo démontre l'application du test Neurosphère pour l'isolement et l'expansion des cellules souches neurales de la éminences ganglionnaires du jour embryonnaire 14 cerveau de souris.

Abstract

Dans les mammifères, les cellules souches agit comme une source de cellules indifférenciées de maintenir la genèse des cellules et de renouvellement dans les différents tissus et organes pendant la durée de vie de l'animal. Ils peuvent éventuellement remplacer les cellules qui sont perdues dans le processus de vieillissement ou dans le processus de blessure et de maladie. L'existence de cellules souches neurales (NSC) a d'abord été décrit par Reynolds et Weiss (1992) dans le système nerveux des mammifères adultes central (SNC) en utilisant un système de culture sans sérum roman, l'essai de Neurosphère (NSA). En utilisant ce dosage, il est également possible d'isoler et d'élargir NSCs de différentes régions du SNC embryonnaire. Ces NSCs dans élargi in vitro sont multipotentes et peuvent donner lieu à trois principaux types de cellules du SNC. Alors que la NSA semble relativement simple à réaliser, attention aux procédures démontré ici est nécessaire afin d'obtenir des résultats fiables et cohérents. Cette vidéo montre pratiquement la NSA pour générer et développer NSCs du jour embryonnaire du tissu cérébral de 14 souris et fournit les détails techniques, on peut obtenir pour les cultures Neurosphère reproductibles. La procédure comprend la récolte d'embryons de souris E14, microdissection cerveau pour récolter les éminences ganglionnaires, la dissociation des tissus récoltés dans le milieu de NSC pour gagner une suspension cellulaire unique, et enfin plaquage cellules en culture NSA. Après 5-7 jours de culture, les neurosphères résultant primaires sont passées à élargir le nombre des CNS pour des expériences futures.

Protocol

1. Configuration de base Avant de procéder à la dissection:

1. Volume approprié de milieu complet NSC est préparée en mélangeant NeuroCult NSC moyen basale et NeuroCult NSC Suppléments prolifération à un ratio 9:1, respectivement.
2. Le milieu est chauffé dans un bain d'eau à 37 ° C.
3. Froid tamponné HEPES milieu essentiel minimum (HEM) à forte concentration d'antibiotiques (10%) est préparé pour la dissection et l'objet à laver. Alternativement, le NSC milieu basal avec une supplémentation en antibiotiques peuvent également être utilisés à cette fin.
4. 25-30 ml de SEM le rhume contenant des antibiotiques est distribué dans des tubes stériles 50 ml pour la collecte des embryons.
5. Plusieurs 10cm en plastique des boîtes de Petri sont nécessaires pour maintenir les embryons et le cerveau lors de la dissection et aussi pour tenir les tissus disséqués.
6. Les outils chirurgicaux, nécessaire pour éliminer les embryons (gros ciseaux, petits ciseaux pointus, pinces grandes, petites pinces courbées) ou pour la dissection du cerveau embryonnaire (petite pince, pinces fines courbes, coudée à 45 ° pinces fines, et de petits ciseaux) sont stérilisés à l'aide billes de verre stérilisateur à 250 ° C ou d'autres méthodes disponibles autoclave.
7. Microscope à dissection est lavée à l'alcool 70% et mis en place dans une hotte à flux laminaire ou PC2.

2. Récolte E14 cerveau de souris et de micro-dissection:

1. Un temps accouplés souris enceinte est anesthésié au 14 ^ème jour de gestation en fonction de son protocole d'animaux institutionnelle approuvée.
2. La dislocation cervicale est effectuée pour s'assurer que l'animal ne souffre pas la douleur et la détresse.
3. La souris anesthésiée est posé sur le dos sur un document papier absorbant, et l'abdomen est rincé à l'éthanol à 70% pour stériliser la région.
4. La peau de l'abdomen est saisie en utilisant une grande pince, puis la peau et le fascia sous-jacent est coupé avec de grands ciseaux pour exposer la cavité abdominale et les cornes utérines.
5. Les utérus sont retirés avec une pince et des ciseaux et de petits sont transférés dans un tube contenant 50 ml conique HEM froid.
6. Les tissus utérins sont transférés à la hotte, puis rincée une fois ou deux fois avec un volume suffisant de produits frais HEM froide stérile pour éliminer les contaminants possibles comme le sang et les cheveux.
7. Les tissus utérins sont ensuite transférés dans une boîte de Petri contenant 10cm HEM froid.
8. Les cornes utérines sont ouverts à l'aide de petites pinces et ciseaux courbes et les embryons sont transférés dans un plat de 10cm de nouvelles, qui contient HEM froid.
9. Les chefs des embryons sont séparés au niveau de la moelle épinière cervicale et transféré à une autre boîte de Pétri contenant HEM froid.
10. La boîte de Pétri est transféré sous un microscope à dissection pour enlever le cerveau du crâne.
11. Les têtes sont organisées avec une pince fine incurvée du côté caudal afin que la face dorsale des têtes sont vers le haut. En utilisant des micro-ciseaux, d'abord une coupe horizontale est faite au-dessus des yeux et a ensuite continué dans la ligne médiane du front vers l'arrière de la tête. Assurez-vous de couper à travers la peau et le crâne et de ne pas endommager le cerveau sous-jacent.
12. Le cerveau est enlevé du crâne en poussant les bords de la section coupée dans un mouvement vers l'arrière à l'aide de la pince courbe. Cette procédure est poursuivie jusqu'à ce que tous les cerveaux sont retirés de ces crânes.
13. Le cerveau est resté stable en utilisant la pince incurvée de sorte que la face dorsale est tournée vers le haut, puis en utilisant microciseaux une coupe est réalisée à travers le cortex de chaque hémisphère s'étend du bulbe olfactif à l'arrière de l'hémisphère pour exposer les éminences ganglionnaires.
14. Utilisation de la pince courbée dans une main et la pince coudée à 45 ° dans l'autre, les volets coupe de cortex sont répartis et les éminences ganglionnaires sont disséquées.
15. Le tissu disséqué est placé dans une boîte de Pétri stériles 10cm, et cette procédure est répétée jusqu'à ce que tous les cerveaux ont été micro-disséqués.
16. Morceaux de tissus sont recueillies à l'aide de 1 mL de milieu NSC dans un bout de 1 mL pipette et transférée dans un tube à centrifuger de 15 ml.
17. Tissu est ensuite dissocié soigneusement, mais doucement en appuyant sur la pointe de la pipette au fond du tube et la suspension de pipetage de haut en bas. De cette façon, les mottes sont divisés en cellules individuelles. Le pipetage est réalisé de telle sorte que 3-4 fois une suspension laiteuse comme est atteint. Ensuite, la suspension est autorisé à s'installer pendant 1-2 minutes afin que les touffes non dissociée précipités.
18. Près de la suspension cellulaire entière est transférée à l'autre tube, puis un autre 1 mL de milieu NSC est ajouté à la mottes restantes et dissocié de cellule unique, comme décrit.
19. Le contenu des tubes sont regroupées et centrifugé pendant 5 minutes à température ambiante, à 700rpm (110g).
20. Le surnageant est aspiré vers le hors réelles de granulés, et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de milieu complet NSC.
21. Le milieu est doucement introduit à la pipette haut et bas pouravoir une suspension cellulaire homogène et unique.
22. 10 ul de la suspension cellulaire est mélangé avec 90 ul de bleu trypan pour effectuer un comptage des cellules.
23. Enfin, les cellules sont étalées à la densité de 2x10 ⁵ cellules / mL dans NSC milieu complet supplémenté avec 20ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF). 5 ml de milieu est utilisé pour T25, T75 pour les 20 ml et 40 ml pour T175 flacons.
24. Neurosphères sont formés dans les 5-7 jours lors d'une incubation à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO _2. Dans 6-7 jours, les sphères doit mesurer entre 150-200 microns et sera prêt à la sous-culture (de passage).

3. Le repiquage et l'expansion du CNS embryonnaires:

1. Lorsque les neurosphères sont prêts pour la sous-culture (150-200 um de diamètre), le milieu avec des sphères suspendues est retiré de la flacons, placé dans une taille de stériles tube approprié la culture de tissus, et centrifugé à 700 rpm (110 g) pendant 5 min à la température ambiante.
2. Le surnageant est éliminé et les sphères sont remis en suspension dans 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA.
3. La suspension cellulaire est ensuite incubée dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2-3 min, puis un volume égal d'inhibiteur de trypsine du soja est utilisé pour arrêter l'activité de la trypsine.
4. La suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas pour s'assurer que la trypsine a été complètement inactivé.
5. La suspension cellulaire est centrifugée à 700 rpm (110g) pendant 5 min. Ensuite, le surnageant est éliminé et les cellules sont resuspendues dans 1 ml de milieu complet NSC.
6. 10 ul de la suspension cellulaire est mélangé avec 90 ul de bleu trypan pour effectuer un comptage des cellules.
7. Les cellules sont étalées à une concentration de 5x10 ⁴ cellules / mL dans le NSC milieu complet supplémenté avec 20ng / ml EGF dans une fiole de culture de la taille des tissus appropriés. 5 ml de milieu est utilisé pour T25, T75 pour les 20 ml et 40 ml pour T175 flacons.
8. Neurosphères secondaires sont formées dans les 5-7 jours lors d'une incubation à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO _2.

4. Les résultats représentatifs:

En premier embryon NSC culture, la majorité des cellules deviennent hypertrophiques et attacher à la culture de tissus plats sur placage. Alors que la majorité des cellules meurent ou se différencier, après 2-3 jours, les cellules prolifératives font de petits amas de cellules qui se détachent du substrat (figure 1). Formation de grands agrégats sphéroïdaux dans les 48 premières heures de la culture ne doit pas être confondu avec les sphères primaires. La formation d'agrégats dépend principalement de la quantité de débris et de mottes de tissu non dissociée de la culture. Neurosphères sont vrais phase brillante et devenir plus sphérique que la taille augmente (figure 2). Microspikes Petite apparaît sur la surface extérieure des sphères viable et saine (figure 3). Après 5-7 jours, les sphères doivent être rondes mais pas compacté et doit mesurer entre 150 et 200 um de diamètre. Si neurosphères sont autorisés à devenir trop volumineux (après 9-10 jours de culture), ils pourraient former des agrégats ou à devenir de couleur sombre à cause de la mort cellulaire au centre de la sphère (voir vidéo). Grand neurosphères pourrait éventuellement commencer à se différencier in situ (fixation sur le substrat et la migration vers la périphérie). Il est également difficile de dissocier neurosphères grandes et les sous-culture.

Figure 1. Primaire E14 NSC culture 3 jours après l'étalement. Les flèches indiquent les clusters prolifération des CNS. Le grossissement est de; 20x

Figure 2. Primaire E14 NSC culture de 7 jours après l'étalement. Le grossissement est de; 10x

Figure 3. Seul passage E14 neurosphères 5 jours après placage. Notez le micro-pointes (flèches) à la périphérie des sphères. Grossissement original; 20x

Discussion

Le test est Neurosphère la méthode de choix pour l'isolement et l'expansion des cellules souches neurales ^1-5 raison de sa simplicité et de reproductibilité. Ce test est un outil précieux pour production à grande échelle des cellules précurseurs du SNC indifférencié, qui pourrait être utilisé à la fois in vitro et in vivo. Il convient de souligner que neurosphères pourrait être généré à la fois du bona fide des cellules souches neurales et les progéniteurs plus restreint. Par conséquent, le calcul de la fréquence Neurosphère formant surestime simplement le nombre de bona fide NSCs dans une population donnée de cellules neurales ^6. Pour estimer la fréquence des bona fide NSCs, il est fortement recommandé d'utiliser la colonie de neurones formant analyse cellulaire (N-ACCP), qui a été développé à cet effet ^7.

Pour avoir une approche cohérente de la culture de haute qualité de Neurosphère E14 NSCs, nous recommandons:

1. Afin de préparer les éléments nécessaires avant de commencer à récolter les embryons.
2. Pour garder les embryons à HEM froid ou basale moyenne NSC travers la dissection.
3. Pour effectuer la dissection aussi rapidement que possible (en 1 h), car le tissu devient molle et collante au fil du temps et peuvent être difficiles à disséquer.
4. Ne pas laisser la sphère pousser trop. Habituellement, ils doivent être repiquées tous les 5-7 jours selon la taille des sphères.
5. Pour trypsiniser les sphères à la taille de 150-200 um pour 2-3 minutes. Laissant de trypsine pendant plus de 3 minutes provoque des dommages aux cellules et l'efficacité de la sphère formant va diminuer et les cellules ont tendance à attacher les boîtes de culture et se différencier.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
Fine curved forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11251‐35
Small fine forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11272‐30
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050‐10
Fine scissors	Surgical tools	World Precision Instruments, Inc.	500216
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.