Summary
Se describe un método para preparar organotípicos rodajas de hipocampo que se pueden adaptar fácilmente a otras regiones del cerebro. Cortes de cerebro se ponen en membranas porosas y medios de cultivo se le permite formar una interfase. Este método conserva la arquitectura bruto del hipocampo durante un máximo de 2 semanas en la cultura.
Abstract
El hipocampo, un componente del sistema límbico, juega un papel importante en la memoria a largo plazo y la navegación espacial 1. Las neuronas del hipocampo puede modificar la fuerza de sus conexiones después de breves períodos de fuerte activación. Este fenómeno, conocido como potenciación a largo plazo (LTP) puede durar horas o días y se ha convertido en el mecanismo mejor candidato para el aprendizaje y la memoria 2. Además, la anatomía bien definida y la conectividad del hipocampo 3 se ha convertido en un sistema modelo clásico para estudiar la transmisión sináptica y la plasticidad sináptica 4.
A medida que nuestra comprensión de la fisiología de las sinapsis del hipocampo creció y los jugadores molecular se identificó, la necesidad de manipular las proteínas sinápticas se convirtió en un imperativo. Organotípicos culturas del hipocampo ofrecen la posibilidad de la manipulación genética fácil y precisa la intervención farmacológica, sino mantener la organización sináptica que es fundamental para comprender la función de la sinapsis en un contexto más natural que los métodos de rutina de la cultura neuronas disociadas.
Aquí presentamos un método para preparar y cultura rodajas de hipocampo que se pueden adaptar fácilmente a otras regiones del cerebro. Este método permite un fácil acceso a los cortes para la manipulación genética por métodos diferentes como la infección viral o biolística 5,6 7. Además, los cortes pueden ser fácilmente recuperados para los ensayos bioquímicos 8, o transferirse a microscopios para imágenes 9 o 10 experimentos electrofisiológicos.
Protocol
1. Antes de iniciar la preparación de cortes de hipocampo.
- Preparar la máquina de cortar el tejido mediante la colocación de una lámina de teflón y el montaje de un disco nuevo.
- Limpie el cultivo de tejidos (TC) capucha con etanol 70% y establecer el interior microscopio de disección. Esterilizar el capó, un microscopio, un cortador de tejido y todos los instrumentos de disección durante 15 minutos con luz UV.
- Preparar seis placas de TC. Añadir 750 medios de comunicación l cultura rebanada (SCM) por pozo y colocar insertos de cultivo de células en cada pocillo. Asegúrese de que las membranas son completamente mojado sin burbujas por debajo. Coloque las placas en la incubadora a 35 ° C gaseada, con 5% de CO 2 hasta que se necesite.
- Verter 50 ml de baja Na + ACSF (disección de solución) en un vaso de 100 ml y colocarlo en la mezcla de hielo y sal. La burbuja de la baja de Na + ACSF con un 5% de CO 2 / 95% O 2 hasta que cambia de color y formas ACSF una mezcla de lechada de la solución congelada y líquidos (10-20 min).
- Obtener una rata P5-P7 cachorro. Hasta tres crías se pueden utilizar.
2. Rebanadas de preparación del hipocampo.
- Cortar la cabeza del animal con una tijera filosa. Cortar la piel y exponer el cráneo. Abrir el cráneo por el corte de lado a lado a lo largo de la línea de interaural y después a lo largo de la sutura sagital con unas tijeras pequeñas. Un corte opcional de lado a lado en la parte delantera se puede hacer para facilitar la eliminación de los huesos y la exposición del cerebro. Saque el cerebro rápidamente con una cuchara de espátula redondeada micro y lo coloca en el lodo de la disección de solución a enfriar por aproximadamente 1 minuto. Vierta unos 10 ml de solución de disección fría en un plato de 60 mm y la transferencia del cerebro del vaso al plato. El cerebro debe ser cubierto con la disección de una solución.
- Bajo el microscopio de disección: Coloque el cerebro y mantenerlo en la línea media con la pinza de disección pegada a la parte inferior de la placa de 60 mm. Use la herramienta de hipocampo de disección para separar los hemisferios del cerebro medio, dejando de lado. Los hipocampos son expuestos en cada hemisferio. Luego, suavemente saque el hipocampo con el hipocampo, la disección de la herramienta. Utilice la aguja de disección para aislar completamente el hipocampo y la limpieza tanto como sea posible.
- Con una punta de cortado de un filtro P1000 punta de pipeta, Aspire con cuidado el hipocampo y su transferencia a la hoja de teflón en la máquina de cortar el tejido. La posición del hipocampo en su lado cóncavo.
- Alinear a la perpendicular de hipocampo de la hoja para obtener cortes coronales y drenar el exceso de líquido.
- Cortar el hipocampo cada 400 micras.
- Vierta unos 10 ml de frío SMC en un plato de 60 mm y la transferencia de rodajas de hipocampo de la máquina de cortar con otro cortó P1000 filtro de la boquilla y SCM frío. Evite hacer burbujas.
- Con la ayuda de una espátula de iris y una espátula recta suavemente separar las rodajas de unos de los otros.
- Separado rodajas bien definidos y en buen estado de las lonjas de daños.
3. Las rebanadas de hipocampo Cultura
- Lleve las placas de seis pozos con SMC y las inserciones de cultivo de células de la incubadora. Con la ayuda de otro cortó P1000 punta del filtro, la transferencia de porciones individuales en la membrana. Coloque rebanadas de 5.4 por membrana. Tenga cuidado de no colocar las rodajas o bien cerca de la pared de inserción o cerca unos de otros. Cuando es necesario, use una espátula para separar las rebanadas del iris. Retire el exceso de medio. Toque rodajas lo menos posible una vez que están en la membrana.
- Mover la placa posterior a la incubadora y la cultura a 35 ° C y CO 2 al 5%.
- Cambiar SMC cada 48 horas dentro de la campana TC por la aspiración del SMC con una pipeta Pasteur. Añadir 750 l de agua dulce precalentado SMC por pozo. Asegúrese de que no se forman burbujas en la membrana.
4. Soluciones
- Bajo Na + ACSF - Solución de disección de las culturas rebanada
Para desionizada y estéril H 2 O añadir:Por 500 ml Para 1000 ml La concentración final CaCl2 (1 M) 0,5 ml 1 mL 1 mM D-glucosa 0,901 g 1,802 g 10 mM KCl 0,149 g 0,298 g 4 mM MgCl 2 (1 M) 2,5 ml 5 ml 5 mM NaHCO3 1,092 g 2,184 g 26 mM Sacarosa 40 g 80 g 234 mm Solución de rojo fenol al 0,5% en DPBS 0,5 ml 1 mL 0,1% v / v
Mix ~ 30 min
Sterilize por paso a través de filtro de 0.22μm
Alícuotas de 50 ml tomar y almacenar a 4 ° C no más de 2 meses. - Rebanada de medio de cultivo (SCM)
Por 500 ml Para 1000 ml La concentración final MEM medio Eagle 4,2 g 8,4 g 8,4 g / l Suero de caballo inactivado por calor 100 ml 200 ml 20% L-Glutamina (200 mM) 2,5 ml 5 ml 1 mM CaCl2 (1 M) 0,5 ml 1 mL 1 mM MgSO 4 (1 M) 1 mL 2 mL 2 mM La insulina (1 mg / ml), disuelta en HCl 0,01 N 0,5 ml 1 mL 1 mg / l El ácido ascórbico, la solución (25% w / v) 0.024 ml 0.048 ml 0,00125% D-glucosa 1.16g 2.32g 13 mM NaHCO3 0,22 g 0,44 g 5,2 mM Hepes 3.58g 7.16g 30 mM
Mezcle hasta que esté completamente disuelta y llevar a temperatura ambiente.
Ajustar el pH a 7.27 a 7.28 con NaOH 1 N
Medir la osmolaridad. Ajuste a 320 mmol / kg con agua desionizada y esterilizada H 2 O. Esperan agregar aproximadamente 25 a 40 mL. Compruebe la osmolaridad de nuevo.
*** PH puede cambiar un poco mientras se ajusta la osmolaridad, esto está bien, es más importante que la osmolaridad está en el rango correcto (317-323).
Esterilizar por paso a través de filtro de 0,22 micras.
Hacer alícuotas de 20 ml y almacenar durante un máximo de dos o tres semanas a 4 ° C.
Acciones Gluatamine: preparar a una concentración de 200 mM y almacenar a -20 ° C en alícuotas de 2,5 ml.
De valores de ácido ascórbico: preparar a una concentración de 25% (w / v) y almacenados a -20 ° C en alícuotas de 100 mL.
5. Los resultados representativos:
Rebanadas debe verse blanca bajo un microscopio de disección sin manchas negro y bien definidos y en buen estado CA1, CA3 y giro dentado regiones. La contaminación bacteriana se ve fácilmente como el movimiento negro moteado en el medio o la turbidez de la SCM. Cuando se coloca bajo el microscopio, la superficie de la porción debe verse limpio después de 4 días de cultivo con los cuerpos de células claras y visiblemente. Si no hay cuerpos de células claras se ven y muchos residuos que cubre la superficie después de 4 días, entonces no es un trozo sano.
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Discussion
Este método se basa en el método descrito por primera vez por Stoppini et al. 11 y ofrece una manera rápida a las rebanadas de hipocampo cultura. El aspecto más importante de este protocolo es la de mantener las rebanadas estéril, por lo tanto, es fundamental utilizar técnicas apropiadas y estéril para desinfectar y esterilizar adecuadamente todo el material en contacto con el tejido.
Fuentes diferentes sueros pueden influir en la calidad de los cortes. Recomendamos probar varios lotes en primer lugar. Si la contaminación es un problema recurrente, revise la incubadora y la capucha de cultivo de tejidos de las posibles fuentes de contaminación. El uso adecuado de técnicas estériles durante todo el procedimiento es esencial.
El tiempo total de la decapitación de colocar las rebanadas en la membrana y en la incubadora no debe ser mayor de 1,5 horas. Si el procedimiento toma mucho tiempo, se pondrá en peligro la salud de los sectores.
Colocar las rebanadas en una membrana porosa garantías oxigenación adecuada y la nutrición a través de una fina capa de SMC que está formado por capilaridad. Este método se puede adaptar a otras regiones del cerebro siempre que la densidad del tejido permite la correcta oxigenación y la penetración de los nutrientes. Por lo tanto, la densidad del tejido límites de este método a los tejidos jóvenes. Para el hipocampo, las rebanadas de 300 a 400 micras de espesor de animales P6-P7 parece dar mejores resultados. Este tipo de cortes rápidamente se puede obtener con una máquina de cortar tejido disminuye el tiempo de exposición del tejido al aire.
Es importante destacar que para aquellos que estudian la fisiología sináptica, después de unos días en la cultura, todos los restos de células muertas se ha eliminado, dejando una superficie limpia y muy adecuado para experimentos electrofisiológicos o de imagen. Además, organotípicos rodajas de hipocampo continuar promoviendo la conectividad normal comparable a rodajas aguda 12. Sin embargo después de 2 semanas en la cultura de la conectividad normal desaparece a medida que las neuronas empiezan a formar demasiadas conexiones que aumenta la actividad sináptica en el sector.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el NINDS - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
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