Summary
نحن تصف طريقة لتحضير شرائح الحصين عضوي النمط التي يمكن تكييفها بسهولة إلى مناطق أخرى من الدماغ. وضعت شرائح الدماغ على الأغشية التي يسهل اختراقها وسائل الاعلام الثقافة يسمح له شكل واجهة. هذا الأسلوب يحافظ على بنية الإجمالي للقرن آمون لمدة تصل الى 2 أسابيع في الثقافة.
Abstract
قرن آمون ، وهو مكون من الجهاز الحوفي ، ويلعب دورا هاما في الذاكرة طويلة المدى والملاحة الفضائية 1. يمكن أن الخلايا العصبية الحصين تعديل قوام صلاتهم بعد فترات وجيزة من تفعيل قوي. ويمكن لهذه الظاهرة ، والمعروفة باسم بعيدة المدى (الكمونية) تستمر لساعات أو أيام ، وأصبحت آلية أفضل مرشح للتعلم والذاكرة 2. بالإضافة إلى ذلك ، بذلت التشريح محددة جيدا ، والتواصل بين الحصين 3 أنه نظام نموذجي لدراسة نقل الكلاسيكية متشابك ومتشابك 4 اللدونة.
كما فهمنا للعلم وظائف الأعضاء من نقاط الاشتباك العصبي الحصين نما وأصبح اللاعبون الجزيئية التي تم تحديدها ، وأصبح من الضروري التعامل مع البروتينات متشابك حتمية. ثقافات الحصين عضوي النمط توفر إمكانية للتلاعب الجيني سهلة ودقيقة ولكن التدخل الدوائي الحفاظ على منظمة متشابك التي تعتبر ضرورية لفهم وظيفة المشبك في سياق طبيعي أكثر من الأساليب الروتينية ثقافة فصل الخلايا العصبية.
هنا نقدم طريقة لتحضير شرائح الحصين والثقافة التي يمكن تكييفها بسهولة إلى مناطق أخرى من الدماغ. هذا الأسلوب يتيح سهولة الوصول إلى شرائح للتلاعب الجيني باستخدام أساليب مختلفة مثل العدوى الفيروسية أو 5،6 biolistics 7. بالإضافة ، يمكن استردادها بسهولة لشرائح فحوصات البيوكيميائية 8 ، أو نقلها إلى المجاهر التصوير 9 أو 10 تجارب الكهربية.
Protocol
1. قبل البدء في إعداد شرائح الحصين.
- إعداد تقطيع الأنسجة عن طريق وضع قطعة من ورقة تفلون وتصاعد شفرة جديدة.
- مسح نسيج الثقافة (TC) هود مع الايثانول 70 ٪ ومجموعة الداخل مجهر تشريح. تعقيم هود ، المجهر ، وتقطيع اللحم والأنسجة وتشريح جميع الصكوك لمدة 15 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية.
- إعداد ست لوحات TC جيدا. إضافة 750 ميكرولتر ثقافة شريحة وسائل الإعلام (SCM) في مكان جيد وإدراج ثقافة خلية في كل بئر. تأكد من الأغشية الرطبة تماما مع عدم وجود فقاعات تحتها. وضع لوحات في حاضنة على 35 درجة مئوية بالغاز مع 5 ٪ CO 2 لحين الحاجة إليها.
- صب 50 مل + ACSF منخفضة نا (تشريح الحل) في كوب 100 مل ووضعه على الجليد الملح المزيج. فقاعة المنخفض الصوديوم + ACSF مع 5 ٪ CO 2 / 95 ٪ O 2 حتى يتغير لونها وACSF أشكال مزيج من الطين حل المجمدة والسائلة (10-20 دقيقة).
- الحصول على الفئران P5 - P7 الجرو. ويمكن استخدام ما يصل الى ثلاثة الجراء.
2. الحصين شرائح التحضير.
- قطع رأس الحيوان مع مقص أداة حادة. قطع الجلد وفضح الجمجمة. فتح الجمجمة عن طريق قطع من جانب إلى آخر على طول خط interaural ومن ثم على طول الدرز السهمي مع مقص صغير. ويمكن إجراء خفض اختياري من جانب إلى آخر في الجبهة لتسهيل إزالة العظام والتعرض للدماغ. يستخرج الدماغ بسرعة مع ملعقة ملعقة صغيرة مدورة ووضعه في الطين من تشريح حل البرد لمدة دقيقة 1 ~. ~ صب 10 مل من محلول الباردة الجليد تشريح على طبق 60 ملم ونقل الدماغ من الدورق إلى الطبق. ينبغي تغطية تشريح الدماغ مع الحل.
- تحت المجهر تشريح : ضع الدماغ والاحتفاظ بها في خط الوسط مع ملقط تشريح الضغط إلى أسفل الطبق 60 ملم. استخدام أداة تشريح الحصين للفصل بين نصفي الكرة الأرضية تاركة الدماغ المتوسط. ويتعرض بعد ذلك الحصين على كل الكرة الأرضية. ثم بلطف الحصين مغرفة بها مع تشريح الحصين الأداة. استخدام إبرة تشريح لعزل تماما الحصين وتنظيفه قدر المستطاع.
- استخدام غيض مقصوص من طرف P1000 ماصة التصفية ، نضح بلطف الحصين وتحويلها إلى ورقة تفلون على تقطيع اللحم والأنسجة. موقف الحصين على جانبها مقعرة.
- محاذاة عمودية الحصين لنصل للحصول على مقاطع الاكليلية واستنزاف فائض السائل.
- الحصين كل شريحة ميكرون 400.
- ~ صب 10 مل الباردة المجلس الاعلى للقضاة في صحن 60 ملم ونقل شرائح الحصين من تقطيع اللحم وباستخدام آخر مقصوص P1000 طرف مرشح المجلس الاعلى للقضاة والباردة. تجنب جعل فقاعات.
- مع مساعدة من ملعقة ملعقة والقزحية مباشرة منفصلة بلطف شرائح من بعضها البعض.
- شرائح منفصلة واضحة المعالم وغير التالفة من الشرائح المتضررة.
3. الحصين شرائح الثقافة
- تقديم لوحات ستة جيدا مع المجلس الاعلى للقضاة وإدراج ثقافة خلية من الحاضنة. مع مساعدة من طرف آخر P1000 مقصوص تصفية ونقل الشرائح الفردية على الغشاء. مكان شرائح 4-5 في الغشاء. يجب الحرص على عدم وضع الشرائح وثيقة إما إلى الجدار إدراج أو قريبة من بعضها البعض. عند الضرورة ، واستخدام ملعقة لقزحية شرائح منفصلة. إزالة الزائدة المتوسطة. شرائح اتصال أقل قدر ممكن مرة واحدة كانت على الغشاء.
- تحرك الصفيحة العودة إلى الحاضنة والثقافة في 35 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- SCM تغيير كل 48 ساعة داخل غطاء TC بواسطة الشفط مع المجلس الأعلى للقضاء ماصة باستور. إضافة 750 ميكرولتر من قبل المجلس الاعلى للقضاة تحسنت جديدة لكل بئر. تأكد من أن يتم تشكيل أي فقاعات تحت الغشاء.
4. الحلول
- انخفاض الصوديوم + ACSF -- حل تشريح للثقافات شريحة
منزوع الأيونات ومعقمة لإضافة H 2 O :ل 500 مل ل 1000 مل التركيز النهائي CaCl 2 (1 م) 0.5 مل 1 مل 1 ملم D - غلوكوز 0،901 ز 1،802 ز 10 ملي بوكل 0،149 ز 0،298 ز 4 ملم MgCl 2 (1 م) 2.5 مل 5 مل 5 ملم NaHCO 3 1،092 ز 2،184 ز 26 مم السكروز 40 غ 80 غ 234 ملي محلول الفينول الأحمر 0.5 ٪ في DPBS 0.5 مل 1 مل 0.1 ٪ V / V
مزيج ~ 30 دقيقة
Sterilإيزي قبل المرور عبر فلتر 0.22μm
جعل aliquots 50 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية لا تزيد على 2 أشهر. - شريحة متوسطة الثقافة (SCM)
ل 500 مل ل 1000 مل التركيز النهائي MEM النسر المتوسطة 4.2 غرام 8.4 غرام 8.4 غرام / لتر حصان المصل الحرارة المعطل 100 مل 200 مل 20 ٪ L - الجلوتامين (200 ملم) 2.5 مل 5 مل 1 ملم CaCl 2 (1 م) 0.5 مل 1 مل 1 ملم MgSO 4 (1 م) 1 مل 2 مل 2 ملم الانسولين (1 ملغ / مل) ، الذائب في حمض الهيدروكلوريك 0.01 N 0.5 مل 1 مل 1 ملغم / لتر حمض الاسكوربيك ، والحل (25 ٪ W / V) 0.024 مل 0.048 مل 0.00125 ٪ D - غلوكوز 1.16g 2.32g 13 ملم NaHCO 3 0.22g 0.44g 5.2 ملي Hepes 3.58g 7.16g 30 ملم
مزيج حتى حل شامل وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة.
ضبط الرقم الهيدروجيني ل7،27-7،28 مع هيدروكسيد الصوديوم N 1
قياس الأسمولية. ضبط إلى 320 ملمول / كغ مع منزوع الأيونات ومعقمة O. 2 H ويتوقع أن تضيف ما يقرب من 25-40 مل. الأسمولية الاختيار مرة أخرى.
*** الحموضة قد تتغير قليلا حين تعديل الأسمولية ، وهذا على ما يرام ، فإنه من المهم أن الأسمولية في النطاق الصحيح (317-323).
تعقيم قبل المرور عبر فلتر 0.22 ميكرون.
جعل aliquots 20 مل وتخزينها لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع في 4 درجات مئوية.
Gluatamine المخزون : إعداد عند تركيز 200 ملم ومخزن في -20 درجة مئوية في aliquots من 2.5 مل.
حمض الاسكوربيك الأسهم : إعداد بتركيز 25 ٪ (W / V) وتخزينها في -20 درجة مئوية في aliquots من 100 ميكرولتر.
5. ممثل النتائج :
وينبغي أن ننظر شرائح بيضاء تحت نطاق تشريح دون بقع سوداء واضحة المعالم وغير التالفة CA1 ، CA3 ، والمناطق التلفيف المسنن. ويعتبر التلوث الجرثومي وبسهولة نقل بقع سوداء في المتوسط أو تعكر المجلس الأعلى للقضاء. عند وضعها تحت المجهر ، يجب على سطح شريحة تبدو نظيفة بعد 4 أيام في الثقافة مع الهيئات واضحة وdiscernibly الخلية. إذا لم يكن هناك أجسام الخلايا واضحة وينظر الكثير من الحطام ويغطي السطح بعد 4 ايام ، ومن ثم لا شريحة صحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند هذا الأسلوب على طريقة وصف لأول مرة من قبل Stoppini آخرون (11) وتقدم على نحو سريع لشرائح ثقافة الحصين. الجانب الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو الحفاظ على شرائح معقمة ، وبالتالي من الأهمية بمكان استخدام تقنيات مناسبة ومعقمة بشكل صحيح لتطهير وتعقيم جميع المواد في اتصال مع الأنسجة.
يمكن الأمصال مصادر مختلفة تؤثر على نوعية الشرائح. نوصي اختبار عدة دفعات الأولى. إذا كان التلوث هو مشكلة متكررة ، والتحقق من حاضنة الثقافة ونسيج الغطاء عن المصادر المحتملة للتلوث. الاستخدام السليم للتقنيات معقمة أثناء العملية برمتها أمر ضروري.
وينبغي إجمالي الوقت لقطع الرؤوس من وضع الشرائح على الغشاء في الحاضنة وبمدة لا تتجاوز 1.5 ساعة. إذا كان الإجراء وقتا طويلا ، وسوف تعرض للخطر صحة الشرائح.
وضع شرائح على الأوكسجين غشاء الضمانات التي يسهل اختراقها والتغذية السليمة من خلال طبقة رقيقة من المجلس الاعلى للقضاة التي شكلتها الشعرية. ويمكن تكييف هذه الطريقة في مناطق أخرى من الدماغ التي تنص على أن كثافة الأوكسجين في الأنسجة السليمة ويسمح اختراق المغذيات. وبالتالي ، كثافة الأنسجة حدود هذا الأسلوب لأنسجة الشباب. عن حصين ، وشرائح 300-400 ميكرون سميكة من P6 - P7 الحيوانات يبدو لإعطاء أفضل النتائج. بسرعة يمكن هذا النوع من الشرائح يمكن الحصول عليها مع تقطيع اللحم والأنسجة تقليص الوقت يتعرض النسيج في الهواء.
الأهم بالنسبة لأولئك الذين يدرسون علم وظائف الأعضاء متشابك ، وبعد بضعة أيام في الثقافة ، وتمت إزالة جميع الأنقاض من الخلايا الميتة ، وترك على سطح نظيف مناسبة للغاية للتجارب الكهربية أو التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، شرائح الحصين عضوي النمط العادي مواصلة تطوير الربط حادة مماثلة لشرائح 12. لكن بعد 2 أسابيع في ثقافة هذا الربط العادي يختفي باسم الخلايا العصبية بدء تشكيل اتصالات كثيرة جدا أن يزيد النشاط في شريحة متشابك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل NINDS -- NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
